硫氧还蛋白对高氧肺损伤保护作用的机制研究

发布时间：2020-10-12 16:42

　　 【目的】建立早产新生大鼠高氧暴露肺损伤动物模型,观察高氧对早产鼠肺组织形态学影响,研究早产新生大鼠在高氧肺损伤肺组织中凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)和硫氧还蛋白(thioredoxin reductase ,Trx)及其还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)的表达变化及意义,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施。 【方法】早产新生SD大鼠128只,生后1d随机分为空气组和高氧组,每组64只。高氧组持续暴露于氧浓度为85%的氧箱内,空气组置于常压空气中。两组分别于空气或高氧暴露后1 d、4 d、7 d、10 d和14 d时,用10%乌拉坦腹腔注射使之麻醉,提取各组早产鼠肺组织,采用HE染色观察肺组织病理学变化;提取各组肺组织总RNA和总蛋白,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Trx和TrxR mRNA表达;免疫组织化学方法检测肺组织ASK1蛋白的表达和分布,Western blot法检测肺组织ASK1蛋白表达水平变化。 【结果】(1)肺组织病理学观察:与对照组比较,高氧组早产大鼠肺组织出现明显肺泡炎性改变和肺发育滞后。(2)免疫组织化学染色结果显示,在早产大鼠肺组织ASK1广泛分布于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中;高氧暴露1 d、4 d的肺组织ASK1蛋白表达分别0.4382±0.0227和0.5270±0.0432,明显高于空气组(0.3458±0.02630和0.3760±0.0058)(P0.01),7 d时下降为0.4343±0.0254,但仍高于空气组(0.3473±0.0220)(P0.01)。(3)高氧组Trx和TrxR mRNA表达强度均明显高于空气组,且二者分别于10 d(0.6860±0.0811)和7 d(2.0351±0.1600)时达高峰(P0.05)。(4)Western blot法检测ASK1蛋白水平变化与免疫组织化学法结果一致。 【结论】高氧暴露可诱导早产大鼠肺组织发生广泛炎症反应,并使肺发育滞后;ASK1参与了高氧肺损伤的发生发展;而Trx系统可能在其中发挥重要保护作用。 【目的】研究高氧暴露对胎鼠肺泡二型上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cell,AECⅡ)硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)及其还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)表达的影响及意义。 【方法】采用胰酶和胶原酶消化19d的胎鼠肺组织块,按照差速离心和反复贴壁法,无菌分离、纯化、原代培养胎鼠AECⅡ,待其生长至亚融合状态时,随机分为空气组和高氧组;于培养箱内静置30min后,空气组置于同一室内空气中,高氧组通10分钟的850mL/L以上纯氧;然后密封培养瓶,置二氧化碳培养箱中培养。二组分别于培养12h、24h和48h时,倒置相差显微镜下观察高氧对细胞形态及活性的影响;采用流式细胞术检测细胞ROS变化及细胞凋亡情况;采用半定量逆转录聚合酶联反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测二组各时间点Trx和TrxR mRNA,Trx1和TrxR1 mRNA的表达;采用western blot检测胎鼠AECⅡ二组各时间点Trx及Trx1表达变化。 【结果】与空气组比较,高氧暴露各时间点随时间延长AECⅡ细胞生长状态明显不良,悬浮细胞增多;高氧暴露各时间点细胞内ROS生成及凋亡细胞明显增加(P 0.01);RT-PCR结果显示高氧暴露12 h和24 h后AECⅡ的Trx、TrxR mRNA和Trx1、TrxR1 mRNA表达增加(P 0.05),48 h后二组表达差异无统计学意义(P 0.05);western blot结果显示Trx和Trx1蛋白表达变化与mRNA有相同变化趋势(P 0.05)。 【结论】高氧暴露使早产大鼠AECⅡ产生过量ROS从而导致AECⅡ细胞损伤和凋亡;高氧暴露可促使胎鼠AECⅡTrx及TrxR的mRNA表达上调;也可诱导Trx蛋白表达增加,提示Trx系统的表达上调对高氧诱导的肺泡二型上皮细胞损伤具有重要保护作用。 【目的】研究抑制人肺腺癌A549肺泡二型上皮细胞硫氧还蛋白(Trx)表达后对高氧暴露A549细胞包括信号级联通路的直接影响。 【方法】体外培养传代A549细胞,在转染siNT或者siTrx 48 h后分别被随机分成空气组和高氧组。空气两组置于空气中,高氧两组通以600mL.L-1中等浓度高氧。分别培养12 h后收获细胞,采用流式细胞术检测各组肺泡二型上皮细胞内活性氧水平及细胞凋亡数量;用western blot法检测MAPKs信号通路中三个亚家族蛋白的磷酸化程度及PI3K/Akt信号通路蛋白的磷酸化水平,另外也检测了两条信号通路上游蛋白ASK1及EGFR的磷酸化水平。 【结果】与高氧对照组相比,①小分子干扰Trx表达明显增加了高氧暴露下A549细胞的ROS水平(P 0.05);②Trx表达抑制明显增加了高氧诱导的细胞凋亡(P 0.05);③Trx表达抑制明显增强了ASK1的活性,降低了EGFR的磷酸化程度(P 0.01);④Trx表达抑制激活了c-Jun N末端激酶1/2(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK1/2)和P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activited protein kinase,p38)的活性(P 0.01),同时抑制了细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)和Akt活性(P 0.01)。 【结论】抑制Trx表达使高氧暴露下A549细胞凋亡数量增加;Trx通过MAPKs和PI3K/Akt信号通路调控高氧细胞损伤与凋亡是高氧暴露肺上皮细胞损伤的作用机制之一。 【目的】研究硫氧还蛋白( thioredoxin, Trx)过表达对高氧诱导的人肺腺癌A549细胞的影响,探讨Trx在高氧细胞损伤中的保护作用。 【方法】体外传代培养A549细胞,待其生长至融合状态时将其分为四组,空气对照组,空气实验组,高氧对照组和高氧实验组。对照组转染空白质粒,实验组转染含Trx目的基因的质粒。转染48h后,高氧两组通以600mL.L-1中等浓度高氧;空气两组置于同一室空气中;分别培养12h后收集细胞,采用流式细胞计数方法检测各组A549细胞ROS生成和凋亡数量;用western blot检测MAPKs信号通路中三个亚家族蛋白的磷酸化程度及PI3K/Akt信号通路蛋白的磷酸化水平;同时也检测两个上游蛋白的磷酸化水平。 【结果】与高氧对照组相比,①高氧实验组细胞ROS产生和凋亡数量明显减少(P 0.05);②Western blot显示,Trx过表达明显降低了ASK1的活性,增加了EGFR的磷酸化程度(P 0.01);③Western blot显示,高氧实验组ERK1/2和Akt磷酸化程度明显增强(P 0.01),JNK和p-38磷酸化程度明显减弱(P 0.05)。 【结论】Trx过表达可减少中等浓度的高氧诱导的肺泡上皮细胞凋亡保护上皮细胞免受高氧诱导的损伤,通过本研究我们进一步证明Trx能通过上调ERK1/2和Akt的活性程度,降低JNK1/2和p-38的磷酸化程度减少高氧诱导的A549细胞凋亡,从而在肺泡上皮细胞抵抗高氧损伤的作用机制中发挥作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R722.6
【部分图文】：

组织结构明显紊乱，肺泡形成显著滞后，典型小直径的肺泡数目较空气组显著减少，肺泡结构简单化和囊泡化。2.2 免疫组织化学法检测肺组织 ASK1 动态表达及分布肺组织染色 ASK1 阳性信号为棕黄色颗粒，其广泛表达于肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等胞浆中，阴性对照无阳性染色。与空气组比较，高氧暴露 1 d，ASK1 表达强度即显著升高（P<0.05），4 d时达高峰，7 d后出现下降趋势，但仍高于对照组（P<0.05）。见图 1-1 和表 1-1。

图 1-2 空气组与高氧组不同时间点 Trx mRNA 表达情况 （M 为 Marker；1、3、5、7、9 和 2、4、6、8、10 分别代表空气组和高氧组 1、4、7、10、14 d）。表1-2 两组新生大鼠肺组织Trx mRNA表达的影响（ x±s）只数 1 d 4 d 7 d 10 d 14 d F 值 P 值 8 0.5641±0.0916 0.5695±0.0901 0.6577±0.0573 0.6860±0.0811a0.6223±0.0490 3.979 0.009 8 0.4402±0.0852 0.4697±0.0863 0.5036±0.0977 0.5125±0.0987 0.5177±0.0270 1.251 0.308 2.802 2.263 3.847 3.841 5.285 0.014 0.040 0.003 0.002 0.000注：与同组其他时间点比较aP＜0.052.4 高氧对肺组织TrxR mRNA表达的影响与空气组相比，高氧暴露1 d TrxR mRNA表达即有增强，但两组差异无统计学意义（P>0.05）；4 d后较空气组明显升高（P<0.01），7 d时达高峰；10 d后有

表1-2 两组新生大鼠肺组织Trx mRNA表达的影响（ x±s）别 只数 1 d 4 d 7 d 10 d 14 d F 值 P 值氧组 8 0.5641±0.0916 0.5695±0.0901 0.6577±0.0573 0.6860±0.0811a0.6223±0.0490 3.979 0.009气组 8 0.4402±0.0852 0.4697±0.0863 0.5036±0.0977 0.5125±0.0987 0.5177±0.0270 1.251 0.308值 2.802 2.263 3.847 3.841 5.285 值 0.014 0.040 0.003 0.002 0.000注：与同组其他时间点比较aP＜0.052.4 高氧对肺组织TrxR mRNA表达的影响与空气组相比，高氧暴露1 d TrxR mRNA表达即有增强，但两组差异无统计学意义（P>0.05）；4 d后较空气组明显升高（P<0.01），7 d时达高峰；10 d后有所降低，但仍高于对照组（P<0.05）。见图1-3，表1-3。
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 钱莉玲,常立文,张谦慎,容志惠;85%高浓度氧长期暴露诱发早产大鼠肺损伤(英文)[J];中国当代儿科杂志;2003年02期

2 常立文;早产儿慢性肺部疾病的防治进展[J];实用儿科临床杂志;2004年02期

3 姜娜;常立文;卢红艳;李文斌;彭琼玲;蔡成;;高氧对早产大鼠肺组织细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响[J];实用儿科临床杂志;2006年24期

4 常立文;;新生儿支气管肺发育不良的诊治[J];中国实用儿科杂志;2007年04期

本文编号：2838020