未成熟脑保护惊厥性脑损伤机制的分子基础

发布时间：2020-10-18 05:23

　　 第一部分持续惊厥发作后影响海马神经元凋亡早期信号传导的相关因素研究 目的:探讨年龄和惊厥持续时间对惊厥持续状态(Status Convulsion,SC)后不同龄期大鼠海马细胞线粒体膜电位(△Ψm)和细胞色素C(Cytochrome,cytC)释放的影响。 方法:健康成年(ARs)和生后20d幼年Wistar鼠(IRs)各80只,经腹腔注射氯化锂—匹罗卡品分别诱发持续惊厥发作30分钟的SC (30′SC)和3小时的SC(3h SC),在SC后3h至7d的6个不同时点上处死动物,采用流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)检测海马细胞线粒体△Ψm和cytC含量,比较两组间的动态变化。 结果:(1)30′SC后3h,两组线粒体△Ψm即开始降低,均于SC后6h降至最低点,分别为6.08±0.43和5.70±0.63,显著低于对照组(P0.01)。(2)30′SC后7d幼年组海马细胞线粒体△Ψm已升至正常对照水平,而成年组却呈缓慢回升趋势,SC后7d仍远低于正常对照组(P0.05)。在SC后3h,3d,7d,幼年组海马细胞线粒体△Ψm显著高于成年组(P0.05)。(3)3h SC后,两组海马细胞线粒体△Ψm均显著低于30′SC后的相同观察时点(P0.05)。(4)偏相关参数分析,在排除年龄的影响后,SC后海马细胞线粒体△Ψm降低的程度与惊厥持续时间呈正相关(r=0.71,P0.05)。(5)不同年龄及不同时程SC后海马cytC的变化与线粒体△Ψm的变化趋势类似。 结论:(1)严重惊厥发作可导致海马细胞线粒体△Ψm降低及cytC的释放。(2)年龄和惊厥持续时间均是影响海马细胞凋亡早期事件变化的重要因素。(3)幼年鼠海马细胞凋亡早期事件的变化较成年鼠明显为轻,并迅速恢复,提示幼年脑内存在一个主动抑制海马细胞凋亡早期事件变化的保护性反应。 第二部分未成熟脑对惊厥性脑损伤相对耐受性的分子调控机理研究 目的:探索SC后不同龄期大鼠海马细胞凋亡调控基因bcl-2和c-jun表达的年龄差异性。 方法:健康ARs和IRs各80只,经腹腔注射氯化锂—匹罗卡品分别诱发持续惊厥发作30分钟的SC (30′SC)和3小时的SC(3h SC),在SC后3h至7d的6个不同时点上处死动物,采用免疫组化观察海马bcl-2和c-jun蛋白的分布,并进行半定量分析,采用RT-PCR和原位杂交测定bcl-2和c-jun mRNA的表达。 结果:(1)正常情况下,幼年鼠海马c-jun蛋白表达较成年鼠明显为高(P0.05)。30′SC后3h,幼年鼠和成年鼠海马c-jun蛋白表达即开始升高,均于SC后6h达到高峰,分别为0.158±0.024和0.225±0.028,显著高于正常对照,12h后开始回落。30′SC后1d,幼年鼠c-jun蛋白表达已降至正常对照水平;而成年鼠直至SC后7d仍显著高于正常对照水平。(2)SC后成年鼠海马c-jun蛋白表达较幼年鼠更为明显,SC后6h反超幼年鼠,SC后6h至7d的5个时点均显著高于幼年组。(3)3h SC后,两组海马c-jun蛋白表达均显著高于30′SC后的相同观察时点。(4)偏相关参数分析,在排除年龄的影响后,SC后海马c-jun蛋白的表达与惊厥时程呈正相关(r=0.78,P0.05)。(5)不同时程SC后两组c-jun mRNA的表达与上述类似。(6)30′SC和3h SC后幼年鼠及成年鼠海马bcl-2蛋白/mRNA表达升高不明显,两年龄组间比较或与正常对照比较,均无明显差异性。 结论:(1)严重惊厥发作将诱导海马凋亡促进基因c-jun的表达增高。(2)年龄和惊厥持续时间均是影响惊厥后海马c-jun表达的重要因素。惊厥持续时间越长,海马c-jun表达越明显。(3)SC后幼年鼠海马c-jun的表达较成年鼠明显为弱,且持续时间短,这可能是未成熟脑抵抗惊厥性脑损伤的机制之一。(4)无论在幼年鼠或成年鼠,SC均不能明显诱发凋亡抑制基因bcl-2的强表达,SC后bcl-2的表达受年龄及惊厥持续时间的影响小。 第三部分BDNF对惊厥性脑损伤的作用及其调控机理研究 目的:观察外源性脑源性神经营养因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)对SC后海马细胞凋亡早期事件(线粒体△Ψm、cytC)和凋亡调控基因(bcl-2、c-jun)的影响,并探索其可能的作用机制。 方法:选用成年Wistar鼠,制作氯化锂-匹罗卡品SC模型,经脑室内注射BDNF、抗BDNF抗体及抗磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(Phosphorylated cAMP Response Element-binding Protein,pCREB)抗体,于注射后6小时处死动物,用FCM检测海马细胞线粒体△Ψm和cytC含量;免疫组化、RT-PCR和原位杂交观察海马bcl-2、c-jun蛋白和相应mRNA的变化。 结果:(1)经正常大鼠侧脑室注射NS后,与无注射对照相比,注射侧海马细胞线粒体△Ψm显著降低、cytC含量明显增高。SC后,与NS注射侧相比,BDNF注射侧海马细胞线粒体△Ψm明显升高(P0.05)、cytC的含量显著降低(P0.01),而抗BDNF抗体和抗pCREB抗体注射侧海马细胞凋亡早期事件却呈现相反变化(P0.05)。与同组无注射对照组相比,BDNF注射对侧海马细胞凋亡早期事件无明显变化(P0.05)。(2)在正常情况下,大鼠一侧脑室内注射(NS、BDNF、抗BDNF抗体或抗pCREB抗体)后,注射侧海马bcl-2及c-jun表达与同组无注射对照比较差异无显著性。在SC组,BDNF注射侧海马bcl-2表达显著高于同组无注射对照组和NS注射组(P 0.05),抗BDNF抗体及抗pCREB抗体注射侧则较NS注射组显著降低(P0.05);而c-jun表达则呈相反变化趋势。(3)在正常状态及SC组,BDNF注射对侧海马bcl-2及c-jun表达与同组无注射对照组相比无显著性差异。 结论:(1)SC后脑室内注射外源性BDNF可上调凋亡抑制基因bcl-2表达,而下调凋亡促进基因c-jun表达,抑制线粒体△Ψm的改变及cytC的释放,从凋亡过程上游关键环节对惊厥性脑损伤产生一定抑制作用。(2)SC后脑室内注射外源性抗pCREB抗体,阻断CREB的磷酸化,可能通过抑制神经元BDNF表达,或直接削弱CREB本身的作用,从而加重惊厥性脑损伤。(3)脑室内注射BDNF在脑内扩散有限,并可诱导注射部位神经细胞损伤。因此,脑室内直接注射方法在临床的应用受限。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2006
【中图分类】：R720.597
【部分图文】：

图 2-1 正常幼年大鼠海马齿状回及 CA3 区 bcl-2 免疫组化阳性细胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)图 2-2 正常成年大鼠海马齿状回及 CA3 区bcl-2 免疫组化阳性细胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)图 2-5 正常幼年大鼠海马齿状回 c-jun 免疫组化阳性细胞(×400）Fig 2-5 Immunostaining for c-jun in nomal infantrat hippocampal dentate gyrus (×400)图2-6 正常成年大鼠海马齿状回c-jun免疫组化阳性细胞(×400)Fig 2-6 Immunostaining for c-jun in nomaladult rat hippocampal dentate gyrus(×400)

图 2-1 正常幼年大鼠海马齿状回及 CA3 区 bcl-2 免疫组化阳性细胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)图 2-2 正常成年大鼠海马齿状回及 CA3 区bcl-2 免疫组化阳性细胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)图 2-5 正常幼年大鼠海马齿状回 c-jun 免疫组化阳性细胞(×400）Fig 2-5 Immunostaining for c-jun in nomal infantrat hippocampal dentate gyrus (×400)图2-6 正常成年大鼠海马齿状回c-jun免疫组化阳性细胞(×400)Fig 2-6 Immunostaining for c-jun in nomaladult rat hippocampal dentate gyrus(×400)

图片资料图 2-1 正常幼年大鼠海马齿状回及 CA3 区 bcl-2 免疫组化阳性细胞（×100）Fig 2-1 Immunostaining for bcl-2 in nomal infantrat hippocampus, including the dentategyrus and the CA3 regions (×100)图 2-2 正常成年大鼠海马齿状回及 CA3 区bcl-2 免疫组化阳性细胞(×100)Fig 2-2 Immunostaining for bcl-2 in nomaladult rat hippocampus, including thedentate gyrus and the CA3 regions(×100)
【参考文献】

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1 陈阳美,谢运兰,曾可斌;点燃癫癎模型大鼠皮层与海马c-fos、c-jun基因的表达[J];临床神经电生理学杂志;2004年01期

2 尚伟,庞琦,刘伟红,李盛梅;神经元凋亡与颞叶癫痫患者海马硬化的关系[J];山东大学学报(医学版);2005年02期

3 蒋莉,蔡方成,张晓萍;大鼠不同成熟期大脑对持续惊厥的耐受性[J];中华儿科杂志;2002年07期

4 蒋莉,蔡方成,李欣,张晓萍;惊厥持续状态中大鼠脑内神经元死亡的年龄特征[J];中华儿科杂志;2002年09期

5 胡越;蒋莉;李欣;张晓萍;;持续惊厥后影响海马神经元凋亡的相关因素[J];中华神经科杂志;2006年01期

本文编号：2845861