第一部分RSV感染气道上皮细胞株TLR1-10 mRNA表达 目的:为了解TLR家族在RSV诱导气道上皮细胞炎症反应中的作用,体外培养9HTEo人类气道上皮细胞株,观察RSV感染后,9HTEo细胞TLR 1-10 mRNA的表达变化。 方法:RSV以MOI为10感染9HTEo细胞3小时后用半定量RT-PCR检测TLR1-10 mRNA表达;感染3、6和9小时后用Q-PCR检测TLR1-10 mRNA的动态变化,并以UV-RSV作为对照。 结果:RT-PCR结果提示RSV感染上皮细胞后TLR2~10 mRNA表达均上调,以TLR2和TLR6变化最为显著;Q-PCR结果显示:(1)9HTEo细胞株可表达TLR1-10 mRNA,其中以TLR4和TLR8 mRNA表达最高;(2) RSV感染上皮细胞6小时和\或9小时后,TLR1-10 mRNA均表达增高,而UV-RSV组TLR1-10mRNA无明显变化。 结论:RSV感染气道上皮细胞株后,TLR1-10 mRNA均被上调,而无复制能力的RSV不能引起TLR1-10mRNA表达的变化,提示RSV诱导TLRs mRNA表达与病毒入胞复制有关。 第二部分RSV感染后气道上皮细胞株TLR4蛋白表达及其功能研究 目的:观察RSV感染后,气道上皮细胞TLR4蛋白表达变化及其信号通路的功能,与RSV在细胞复制的关系,进一步探讨RSV诱导气道炎症的可能机制。 方法:体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-,RSV以MOI为10感染上皮细胞24小时后(1)用流式细胞术检测TLR4表达及与凋亡的关系;(2)用ELISA检测RSV感染上皮细胞经LPS刺激,并加入TLR4阻断剂HTA125后,上清液中IL-8,IL-6和RANTES的含量;(3)运用TLR4特异性的siRNA干扰9HTEo细胞TLR4表达后,接种RSV并予以LPS刺激,用ELISA法检测上清液中IL-8,IL-6的水平。用TLR4特异性siRNA干扰9HTEo细胞24小时后,①RSV以MOI为0.1感染细胞,连续3天收集上清液用Adeasy TCID50法检测RSV感染性滴度的变化;②RSV以MOI为10感染细胞48小时,ELISA方法检测上清液中IL-8,IL-6,TNF-α和MCP-1的变化;③RSV以MOI为10感染细胞24小时后,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。 结果:RSV感染9HTEo上皮细胞,膜上TLR4表达增高而胞内TLR4表达降低,TLR4阳性细胞百分比明显增加,其中绝大部分为膜Annexin V阳性细胞;LPS诱导的IL-6和部分IL-8可被HTA125阻断,RANTES无明显变化;在TLR4表达被干扰的情况下,LPS刺激仅能诱导产生部分IL-8,不能诱导产生IL-6。TLR4-siRNA组的RSV滴度变化与正常9HTEo细胞组无统计学差异;RSV诱导的IL-6和MCP-1水平在TLR4-siRNA 200nM组明显低于对照组,而IL-8和TNF-α的水平无明显变化;TLR4-siRNA组RSV诱导AnnexinV阳性同时PI阴性的细胞群体百分比在TLR4-siRNA组明显高于对照细胞组。 结论:RSV感染9HTEo细胞后,LPS再刺激产生IL-6是依赖于TLR4信号通路。气道上皮细胞TLR4通路与RSV复制、RSV诱导上皮细胞分泌IL-8无关,但与病毒诱导上皮细胞分泌IL-6和MCP-1,以及病毒感染细胞发生凋亡有关。 第三部分RSV感染后气道上皮细胞株TLR3蛋白的表达及其功能研究 目的:观察RSV感染9HTEo上皮细胞后, TLR3蛋白表达变化及其信号通路的功能。 方法:体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-,RSV(1)以MOI为1感染上皮细胞24小时后,提取细胞总蛋白,用Westernblot的方法检测TLR3表达的变化,以TLR3激动剂PolyIC刺激为对照;(2)以MOI为10接种上皮细胞4小时后,直接加入PolyIC到培养上清或用脂质体将PolyIC转染至细胞内刺激48小时后,用ELISA检测上清液中IL-8,IL-6, IFN-α和IFN-β的表达。 结果:RSV感染后9HTEo上皮细胞后,TLR3蛋白表达量明显增高,再经胞内TLR3激动剂PolyIC刺激后,培养上清IL-8,IL-6和IFN-β含量明显增加。 结论:RSV诱导上皮细胞TLR3蛋白表达增高,TLR3通路可介导IL-8和IL-6和少量IFN-β产生,提示TLR3通路可能主要诱导上皮细胞炎症反应而不是抗病毒反应。 第四部分白藜芦醇抑制RSV感染气道上皮细胞株炎症介质的产生及其机制研究 目的:以地塞米松和利巴韦林为对照,观察白藜芦醇对RSV复制和对RSV诱导的上皮细胞炎症反应作用及其机制研究。 方法:(1)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞和Hep-2细胞株,RSV以MOI为0.1接种Hep-2细胞和9HTEo细胞4小时后,加入适宜浓度的白藜芦醇,地塞米松和利巴韦林,连续5天收集各组上清液,用AdeasyTCID50方法检测计算RSV滴度的变化;(2)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞,RSV以MOI为10接种9HTEo细胞4小时,将PolyIC转染至细胞内后再加入适宜浓度白藜芦醇,地塞米松或利巴韦林至48小时后,用ELISA检测上清液中IL-8,IL-6的表达。(3)体外培养人类气管上皮细胞株9HTEo-细胞,RSV以MOI为1接种9HTEo细胞4小时,加入适宜浓度白藜芦醇,地塞米松或利巴韦林,48小时后收集细胞提取蛋白用Westernblot检测TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达的变化。 结果:Hep-2细胞-白藜芦醇100μM处理组和9HTEo细胞-白藜芦醇处理组的RSV滴度明显低于单纯RSV组,相应细胞的地塞米松处理组的RSV滴度无明显变化,而利巴韦林组的RSV滴度明显低于单纯RSV组。RSV感染9HTEo细胞后,白藜芦醇组和地塞米松组的IL-6水平明显降低,但IL-8无明显变化,利巴韦林组的IL-8和IL-6水平明显降低;RSV感染9HTEo细胞后再给与胞内PolyIC刺激后,白藜芦醇组,地塞米松组的IL-8和IL-6水平均明显降低,而利巴韦林组IL-8和IL-6无明显变化。RSV感染9HTEo细胞后,白藜芦醇处理组的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达明显降低,TLR3蛋白无明显变化;地塞米松组和利巴韦林组的TLR3蛋白,TRIF蛋白和TBK-1蛋白的表达均明显降低。 结论:白藜芦醇可抑制RSV在气道上皮细胞中的复制和抑制dsRNA-TLR3通路的TRIF蛋白和TBK-1蛋白表达,从而抑制RSV诱导上皮细胞分泌的IL-6,提示白藜芦醇抑制RSV感染后气道炎症反应的作用。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：
RSV 核酸 RT-PCR 产物本 2：阳性对照 3：阴phresis of RSV nucleotiPositive Control 3：繁殖的 RSV 滴度，根稀释度病毒感染后细ication manual （ver选择偏小值计算 TCD50/ml。
图 1-2 TCID50 法检测 RSV 滴度（A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID50/mFig 1-2 RSV titration by TCID50 assay (A：106.5TCID50/ml B：106.7TCID502.1.2 RSV 病毒感染 9HTEo 上皮细胞株气道上皮细胞是 RSV 复制的靶细胞，而我们选用的细胞株来源于人类皮细胞，因此首先我们需要确定 RSV 能否感染 9HTEo 细胞。RSV 以 MO感染 9HTEo 细胞感染 24 小时后，显微镜下观察可见明显的细胞融合病变荧光免疫法也可检测到细胞内可见绿色荧光，说明 RSV 病毒能够感染 9H胞株，而 UV-RSV 接种的细胞无明显病变。
RSV染 9HTEo 细胞后的细胞病变和直接荧光免疫检测结pathological effect of RSV-infected 9HTEo cells anddetection by direct fluorescent assay (×100 )TEo 上皮细胞株 3 小时后 TLR1-10 m示 9HTEo 细胞株可表达 TLR1~10，TLR1 表K）TLR mRNA 表达，凝胶成像可见 RSV 组R4 的其余 TLR 条带亮度增强，mRNA 表达呈最为明显。1 23456 789101112
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2845873
