siRNA沉默CHOP基因表达对高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2020-11-16 01:38

【摘要】：目的支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是严重威胁早产儿尤其极早早产儿的一种常见肺部疾病。前期研究发现,在高氧诱导的BPD中,肺泡Ⅱ型上皮细胞(type II alveolar epithelial cells,AECⅡs)凋亡增加,且通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)凋亡途径活化。但CHOP表达改变对高氧暴露后AECⅡs凋亡是否产生影响,目前尚不清楚。本研究主要通过检测被CHOP-siRNA转染的AECⅡs细胞株在高氧暴露后CHOP、Bcl-2和Bax的表达水平以及AECⅡs凋亡情况,探讨阻断内源性CHOP表达对高氧暴露AECⅡs凋亡的影响。方法体外设计合成靶向CHOP基因的siRNA碱基序列,采用Lipofectamine2000脂质体介导法对AECⅡs细胞进行pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA及pcDNA3.1(+)-空质粒瞬时转染,RT-PCR和Western blot检测siRNA干扰后CHOP基因沉默效果。转染后24 h给予高氧暴露,将细胞分为空气组、空气+pcDNA3.1(+)-空质粒组、空气+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA组、高氧组、高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组、高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA组。倒置相差显微镜观察细胞形态,于空气或高氧暴露48 h收集各组细胞,Annexin V/PI双染法及流式仪检测早期细胞凋亡,RT-PCR及Western blot检测CHOP、Bcl-2及Bax表达水平。结果(1)空气组AECⅡs伸出较多伪足,紧贴于瓶底,呈岛状生长方式,空气+pcDNA3.1(+)-空质粒组及空气+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA组细胞形态与空气组相比无明显差异;高氧组AECⅡs伸展肥大明显,细胞贴壁不紧,伪足减少,核仁减少或消失,培养液中悬浮细胞数增加,少数细胞出现空泡改变,高氧+pcDNA3.1(+)-空质粒组与高氧组相比无明显差异;高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA组细胞形态较空气组稍有伸展肥大,但较高氧组细胞伸展程度变小,悬浮细胞数减少,且细胞无空泡改变。(2)与空气组相比,高氧组AECⅡs凋亡明显增加,CHOP基因mRNA及蛋白表达增加,Bcl-2基因mRNA及蛋白减少,Bax基因mRNA及蛋白表达增加。(3)AECⅡs转染CHOP-siRNA后,与高氧组相比,高氧+pcDNA3.1(+)-CHOP-siRNA组AECⅡs凋亡减少,CHOP基因mRNA及蛋白表达减少,Bcl-2基因mRNA及蛋白表达增加,Bax基因mRNA及蛋白表达减少。结论(1)高氧可导致AECⅡs凋亡增加,CHOP表达增加,抗凋亡基因Bcl-2减少,促凋亡基因Bax增加,提示高表达的CHOP可通过下调抗凋亡基因Bcl-2表达及促进促凋亡基因Bax的表达,最终导致细胞凋亡增加。(2)AECⅡs转染CHOP-siRNA阻断CHOP表达后,可减轻高氧诱导的AECⅡs凋亡。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R722.6
【文章目录】：
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第一章 前言
    1.1 研究背景
    1.2 主要研究内容、目标及意义和技术路线
        1.2.1 主要研究内容
        1.2.2 主要研究目标
        1.2.3 主要研究意义
        1.2.4 技术路线
第二章 siRNA沉默CHOP基因对高氧暴露AECⅡs凋亡的影响
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验用细胞株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要试剂的配制
        2.1.4 主要设备和器材
    2.2 实验方法
        2.2.1 AECⅡs培养
        2.2.2 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA及pcDNA3.1（+）-空质粒瞬时转染
        2.2.3 pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA瞬时转染效果检测
        2.2.4 高氧细胞损伤建立及分组
        2.2.5 倒置相差显微镜观察AECⅡs形态
        2.2.6 RT-PCR检测各组细胞CHOP、Bcl-2及BaxmRNA表达
        2.2.7 Western blot检测各组细胞CHOP、Bcl-2及Bax蛋白表达
        2.2.8 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡
    2.3 统计学分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 pcDNA3.1（+）-空质粒及pcDNA3.1（+）-CHOP-siRNA转染结果
        2.4.2 倒置相差显微镜观察AECⅡs形态
        2.4.3 CHOP-siRNA对CHOP基因mRNA及蛋白表达的影响
        2.4.4 CHOP-siRNA对Bcl-2基因mRNA及蛋白表达的影响
        2.4.5 CHOP-siRNA对Bax基因mRNA及蛋白表达的影响
        2.4.6 流式细胞术检测CHOP沉默对细胞早期凋亡的影响
    2.5 讨论
第三章 结论
参考文献
综述 肺泡上皮细胞凋亡介导肺损伤的研究进展
    参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的论文

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本文编号：2885465