PcG家族蛋白在神经管畸形中的表达调控

发布时间：2020-11-18 21:46

　　 研究背景： 神经管畸形(NTD)是一类发病率高且后果严重的先天畸形,受遗传和环境交互作用的影响。孕妇叶酸缺乏是导致NTD的原因之一,但是在孕妇叶酸不缺乏的情况下,仍有一些因素可导致NTD发生。表观遗传修饰在神经系统发育中起了重要作用,PcGs (Polycomb groups)蛋白被认为是其核心部分。目前,人们多关注PcG蛋白是通过影响下游基因参与细胞分化和胚胎发育,却很少有人报道上游哪些机制调控着PcG蛋白表达。MicroRNAs (miRNAs)是一类与转录后基因沉默有关的小RNA分子。MiRNAs是否在神经系统发育过程中能够调节PcG蛋白的表达目前仍不清楚。此外,PcG蛋白与细胞凋亡密切相关,动物实验表明,神经上皮细胞凋亡过度,是导致神经管闭合延迟,引发NTD。细胞凋亡是否与胎儿NTD发生直接相关目前仍不清楚。本研究从PcG蛋白的表达调控和细胞凋亡两个角度深入探讨导致神经管畸形发生的分子机制。 研究目的： 在母亲叶酸不缺乏的情况下,研究PcGs家族蛋白在神经管畸形儿神经和胎盘组织中的表达调控,探讨神经管畸形儿发育过程中神经和胎盘组织中细胞凋亡的发生规律。 研究方法： 1.利用电化学发光法,检测NTD组和对照母亲血清叶酸水平。 2.利用Western blot技术,检测Polycomb家族核心蛋白EZH2,SUZ12,EED和BMI1在NTD儿和对照组儿神经组织和胎盘组织中的表达。 3.利用PicTar,Targetscan和miRanda等生物信息学软件预测可能调节表达异常的PcG蛋白—EED的microRNA(miRNA)。 4.运用TaqMan MicroRNA Arrays检测预测的靶基因为EED的miRNA在胎盘和神经组织中的表达。 5.利用RT-Realtime PCR、Western blot、双荧光素酶活性分析等分子生物学方法验证miRNAs与EED的相互作用。 6.利用原位末端标记技术(TUNEL)研究NTD组和对照组在胎盘组织和神经组织中的细胞凋亡发生状况。 研究结果： 1.NTD组和对照组母亲血清叶酸水平均在正常范围内,且两组之间无明显差异(P=0.4464)。 2.EZH2,SUZ12,BMI1,EED蛋白在NTD组和对照组的胎盘和神经组织均有不同程度的表达。其中,发现EED蛋白在NTD组胎盘、大脑皮质、脊髓组织中均存在差异表达,在NTD组的胎盘和脊髓组织中表达明显升高(P0.05),在大脑皮质中表达显著降低(P0.05)。 3.生物信息学预测miR-30b,miR-30c and mi-R181b的靶基因可能为Eed,这些miRNAs与Eed的3'UTR互补的"seed"片段在不同物种间是高度保守的。 4. miRNA与其靶基因存在反向调节关系,为了分析预测的miRNAs哪些可能调节EED的表达,TaqMan MicroRNA Arrays是被用来检测miRNA在胎盘和神经组织中的表达。研究发现miR-30b在脊髓组织和大脑皮质,miR-30c胎盘组织及miR-181b在脊髓组织中与EED存在反向表达,提示了miR-30b,miR-30c和miR-181b均有可能调控EED的表达,其调控关系可能受组织特异性影响。 5.双荧光素酶活性分析显示,miR-30b和miR-30c与包含"seed"片段PGL3-EED3'-UTR的质粒共转染细胞能显著降低酶活性,提示miR-30b和miR-30c的"seed"片段作用于Eed的3'-UTR区,Eed为miR-30b和miR-30c的靶基因。 6.利用Western blot和Real Time PCR检测过表达或敲低miR-30b,miR-30c或miR-181b后内源性EED蛋白和mRNA水平的表达发现,升高miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明显下调(P0.05)；降低miR-30b或miR-30c,EED蛋白水平明显上调(P0.05),其mRNA水平均没有明显变化。无论升高或降低mi-R181b,EED蛋白水平和mRNA水平均没有明显变化。这些结果进一步证实了miR-30b和miR-30c均可调节EED的表达。 7.在体研究胎盘和神经组织中的细胞凋亡水平发现,在大脑皮质NTD组的细胞凋亡指数低于对照组(p0.05)；胎盘绒毛组织细胞凋亡指数明显大于正常胎盘绒毛组织的细胞凋亡指数(p0.01)。 结论： 1、在非叶酸缺乏的神经管发育缺陷过程中,Polycomb家族蛋白表达分布具有组织特异性,且EED蛋白在胎盘和神经组织中均存在差异表达。 2、在非叶酸缺乏的神经管发育缺陷过程中,miR-30b在NTD组神经组织中差异表达,miR-30c在NTD胎盘组织中差异表达。 3、首次证实EED是miR-30b和miR-30c的靶基因,且miR-30b和miR-30c可以调节内源性EED的表达。 4、在非叶酸缺乏的神经管发育缺陷过程中,NTD的发生与胎盘和神经组织中异常的细胞凋亡密切相关。
【学位单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R748
【部分图文】：

图1EzHZ、suzlZ、BMll和EEn在胎盘，大脑皮质和脊髓组织中的表达Fig.lEZHZ，SUZ12，BMllandEEDexPressioninPlaeetaandneuraltissuesinhuman.w亡StemblottingwasusedanalyzedtheexPressionoftheEzhZSUZ12BMlandEEDinPlacenia，eerebralcortex，sPinaleordfromPregnantwomenwithbabiesonormality(eonirol)andNTD(NTD).ThebandswereanalysedusingtheQuantityOn

提示了ml’R一30b，ml’R一30c和mi一Isjb均有可能调控EED的表达，其调控关系可能受组织特异性影响，miR一30b和mi一R了Slb可能主要在神经组织中发挥作用，ml’R一30c可能主要在胎盘组织中发挥作用。(图3)。根据在NTD神经组织和胎盘组织中miRNAS与EED表达趋势相反的现象和软件预测的两者之间存在结合位点，为验证两者之间的关系，我们在人神经胶质瘤细胞系(U343细胞系)中利用双荧光素酶活性分析和改变内源性miRNAs观察对内源性EED表达的影响。3、Eed3，uTR质粒及对照质粒的荧光素酶活性测定3.1过表达或敲低m1RNA后U343细胞系内miRNA的改变利用脂质体转染化学合成的ml’R一勿b，miR一30c，或miR一ISIb的模拟物和抑制物后，使用 ABITaqmanmicroRNAassays测定细胞内的miRNA水平，确定其内源性miRNA表达是否改变。结果显示，当转染ml’R一30b

miRNA表达是否改变。结果显示，当转染ml’R一30b，ml’R一30c或ml’R181b的模拟物后，U343细胞内相应的而RNA确表达升高。同样，当转染miR一了0b，miR一了0c或miR一ISIb抑制物后，U343细胞内相应的miRNA水平降低(图4)。说明miR一了0b，miR一刃c，ml’R一ISIb模拟物和抑制物有效，我们能成功过表达或敲低细胞内miRNA水平。 3.2Eed3，UTR质粒及对照质粒的荧光素酶活性测定构建了包含预测的与ml’R一勿b，miR一 30candmi一I81b的“seed”互补的Eed的3忆uTR片段的PoL3一promoter-EEn3几uTR的质粒(EED一luc)以及对照的敲除该‘，seed’，片段的质粒(EED一luc一di)。将miRNA模拟物
【参考文献】

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本文编号：2889240