第一部分 RSV感染裸鼠模型的建立及病理特征分析目的：呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)感染是全球关注的公共卫生问题之一,至今缺乏安全有效的防治措施。适应性免疫及固有免疫均参与RSV致病,其中适应性免疫的作用得到了较好的阐释。近年来,固有免疫应答在多种疾病中的作用越来越引起重视,相伴随的,裸鼠、Rag-/-小鼠等适应性免疫缺陷鼠被广泛应用,但至今尚无研究系统探讨RSV在免疫缺陷小鼠中的病理特征及致病机制。裸鼠是一种T细胞缺陷但固有免疫正常的小鼠品系,本研究拟建立RSV感染裸鼠模型,在裸鼠中排除T细胞干扰的情况下,观察RSV的复制情况及病理特征(包括气道炎症细胞浸润、肺组织病理损伤及气道高反应性(Airway Hyperresponsiveness, AHR)),为进一步探讨固有免疫在RSV致病中的作用机制奠定基础。方法：6-8周雌性T细胞缺陷裸鼠(BALB/c背景)及野生型正常BALB/c小鼠分为对照组及RSV组,分别滴鼻接种细胞培养上清或RSVA2病毒液,于感染后第1-7天,第9天、12天及14天收集全肺组织,空斑实验检测病毒滴度；于第1天、3天、5天、7天、14天、21天、30天及60天灌取支气管肺泡灌洗液(Bronchoalvo larlavage fluid,BALF)并行炎症细胞计数及分类计数；部分小鼠取左肺,HE染色后行组织病理评分；肺功能检测采用全身体积描技法；BALF中细胞因子的测定采用ELISA法。结果：(1)裸鼠及BALB/c小鼠肺组织中RSV复制高峰在第3天,感染后4天内,裸鼠中病毒滴度低于BALB/c小鼠,但在第9天及第12天,裸鼠中仍能检测出病毒复制,而BALB/c小鼠中则不能；(2)RSV在裸鼠及BALB/c小鼠中均引起明显的炎症细胞浸润、肺组织病理损伤及AHR,这些异常改变在第1天既已出现,于第5-7天达高峰,之后逐渐降低,但直至第60天仍未完全恢复正常；(3)RSV在裸鼠及BALB/c小鼠中引起细胞因子发生双相变化,感染后第1天,Ⅰ型干扰素在两种小鼠中明显升高,以裸鼠中升高更为显著,之后恢复正常；第5-7天,BALB/c小鼠中IFN-y显著升高,至第14天恢复正常,但在裸鼠中IFN-y始终处于基线水平；感染后期,尤其是在第21天及第30天,Th2类细胞因子及Thl7类细胞因子在两种小鼠中均显著升高。结论：(1)裸鼠中病毒清除延迟,提示固有免疫虽能控制感染早期RSV复制水平,但病毒的有效清除依赖于T细胞；(2)固有免疫可不依赖于T细胞,独立介导RSV相关急慢性期气道炎症及AHR；(3)RSV感染裸鼠及BALB/c小鼠后,引起细胞因子发生双相变化,但细胞因子谱有所不同,提示不同时期、不同免疫背景小鼠中RSV的致病机制存在差异。第二部分 MMP-12不依赖于IFN-γ介导裸鼠RSV感染后急性期气道炎症及AHR目的：课题组前期研究已证实RSV感染BALB/c小鼠第5天,IFN-γ显著升高,并介导了急性期气道炎症及AHR,但尚未明确IFN-γ的主要来源。本研究第一部分结果显示RSV感染裸鼠后,虽引起明显的气道炎症及AHR,但IFN-γ无明显变化,提示存在IFN-γ非依赖的致病机制。因此,本部分在此基础上,拟进一步阐明RSV诱导产生的IFN-γ的主要来源,并深入探讨IFN-γ非依赖的致病机制。方法：6-8周雌性裸鼠及BALB/c小鼠滴鼻接种RSV后第1天、3天、5天、7天及第9天检测相关指标并收集标本。流式细胞术检测肺组织中T细胞及NK细胞,并标记胞内IFN-γ。采用兔抗鼠asialo GM1抗体去除NK细胞。采用ELISA法测定BALF中细胞因子。用MMP408灌胃特异性阻断MMP-12,抗小鼠IFN-γ单抗及外源性重组小鼠IFN-γ因子则经腹腔注射给药。白藜芦醇腹腔注射后滴鼻给予含SARM siRNA或阴性对照质粒的转染试剂,Western Blot检测肺组织中SARM、 TRIF的表达。肺功能检测采用全身体积描记法。结果：(1)RSV感染后,裸鼠中IFN-γ始终处于基线水平;BALB/c小鼠中IFN-γ、CD3+CD4+IFN-γ+Thl细胞及CD3+CD8+IFN-γ+Tc1细胞于感染后第5天均明显增多；BALB/c小鼠中去除NK细胞后IFN-γ无明显变化；(2)RSV感染裸鼠后第3-9天,MMP-12明显升高；BALB/c小鼠中MMP-12第7天开始升高,第9天时显著高于对照组；用MMP408特异性抑制MMP-12后,两种小鼠中气道炎症及AHR明显缓解；(3)RSV感染第5天,用重组小鼠IFN-γ因子处理裸鼠后,IFN-γ升高,MMP-12显著降低;用抗小鼠IFN-γ单抗处理BALB/c小鼠后,IFN-γ降低,MMP-12显著升高；(4)RSV感染裸鼠第5天,SARM表达降低,TRIF明显升高；白藜芦醇处理后,SARM恢复正常,TRIF及MMP-12降低,气道炎症及AHR减轻；白藜芦醇处理后转染SARM siRNA, SARM被有效沉默,TRIF、MMP-12再次显著升高,白藜芦醇的抗RSV作用被逆转。结论：(1)RSV诱导产生的IFN-γ主要来自T细胞；(2)MMP-12可不依赖于IFN-γ,介导部分RSV相关急性气道炎症及AHR;(3)IFN-γ可抑制MMP-12产生；(4)裸鼠中,RSV引起MMP-12升高受SARM-TRIF信号通路调控。研究结果率先证明SARM-TRIF对MMP-12的调控作用,进一步揭示了TLRs网络与肺部基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)之间错综复杂的关系,尤其强调了SARM-TRIF-MMP-12可作为防治RSV感染的潜在干预靶点。第三部分 NK细胞分泌Th2类及Th17类细胞因子介导裸鼠RSV感染后期慢性气道炎症及AHR目的：RSV可引起长期持续的气道炎症及AHR,且与反复喘息和哮喘的发生密切相关,但具体机制不清。本研究第一部分结果显示RSV感染裸鼠及BALB/c小鼠后,气道炎症及AHR可持续至少60天,感染后期,Th2类及Th17类细胞因子显著升高。既往认为这类细胞因子主要来自T细胞,裸鼠缺乏T细胞,肺部NK细胞含量较多,NK细胞是固有免疫的关键成分之一,其在RSV感染急性期及哮喘中的作用均已得到证实,但NK细胞是否参与RSV感染后期的致病尚未见报道。本部分拟进一步探讨NK细胞能否通过分泌Th2类及Th17类细胞因子促进RSV相关慢性气道炎症及AHR的形成或维持。方法：6-8周雌性裸鼠及BALB/c小鼠接种RSV后第7天、14天、21天、30天及第60天检测相关指标并收集标本。流式细胞术检测肺组织中T细胞及NK细胞。采用兔抗鼠asialo GM1抗体去除NK细胞,用抗小鼠CD8a单抗去除CD8+T细胞,上述抗体及白藜芦醇经腹腔注射给药,全身体积描记法检测肺功能,ELISA检测相应细胞因子,Q-PCR法检测TLRs mRNA水平,Western Blot检测肺组织中TRIF蛋白表达。结果：RSV感染后期：(1)裸鼠肺组织中T细胞几乎检测不到,NK细胞显著增多,去除NK细胞或白藜芦醇处理减少NK细胞后,Th2类及Th17类细胞因子显著降低,气道炎症及AHR明显缓解；(2)BALB/c小鼠中NK细胞及T细胞均显著增多,去除NK细胞后,T细胞未受影响,Th2类及Th17类细胞因子降低,气道炎症及AHR明显缓解；白藜芦醇处理后,NK细胞及T细胞均减少,且Th2类及Th17类细胞因子降低的幅度、气道炎症及AHR缓解的程度较单纯去除NK细胞明显；(3) BALB/c小鼠中去除CD8+T细胞后,NK细胞及CD4+T细胞显著增多,Th2类及Th17类细胞因子进一步升高,气道炎症及AHR加重；(4)两种小鼠中多种TLRs及TRIF表达升高,白藜芦醇处理后,TRIF表达被显著抑制。结论：(1)NK细胞可分泌Th2类及Th17类细胞因子,介导RSV相关慢性气道炎症及AHR；裸鼠中,NK细胞是Th2类及Th17类细胞因子的主要来源,而BALB/c小鼠中,NK细胞可不依赖于T细胞或与T细胞协同促进Th2类及Th17类细胞因子升高；(2)RSV感染后期,CD8+T细胞通过抑制NK细胞及CD4+T细胞发挥保护作用；(3)RSV感染后期,NK细胞、T细胞的募集和(或)活化与TRIF信号通路有关。研究结果为深入认识病毒感染后反复喘息和哮喘的发生机制、寻找新的干预靶点提供了重要理论依据。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：
２．２小鼠肺组织中ＲＳＶ滴度测定??２．２．１?ＲＳＶ引起的合胞病变??如图１．２所示，民ＳＶ组小鼠肺组织匀浆接种Ｈｅｐ－２细胞后产生明显的合胞病??变，细胞融合成片，可见拉丝，结果提示ＲＳＶ接种成功。??■ｍ??图１．２小魚肺匀浆接种Ｈｅｐ－２细胞后细胞病变效应化ＰＥ）??Ａ：对照组Ｂ：?ＲＳＶ惠染组??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ?ｅｆｆｅｃｔ?（ＣＰＥ）?ｏｆ?Ｈｅｐ－２?ｃｅｌｌｓ?ａｆｔｅｒ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ｍｉｃｅ?ｌｕｎｇ??ｔｉｓｓｕｅ?ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ??Ａ；?Ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?Ｂ：?ＲＳＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｍｉｃｅ?ｇｒｏｕｐ??３０??
ｗｉｔｈ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ．??２丄２小鼠肺组织Ｔ细胞及ＮＫ细胞计数??如图３．２所示．民ＳＶ感染裸鼠后第２１天（ＰＣＯ．Ｏｌ）及第３０天（ＰＣＯ．ＯＯｎ，??肺组织中ＮＫ细胞（ｂ）显著高于其对照组：民ＳＶ感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后第２１天及??第３０天，肺组织中Ｔ细胞（ａ）及ＮＫ细胞均显著高于对照組。裸鼠肺组织中Ｔ??细胞显著低于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（Ｐ＜０．００１），而ＮＫ细胞显著高于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠ＣＰ??＜０．０１）。??３〇－｜?？目ＡＬＢ／Ｃ?ｍｉｃｅ?－＊？目ＡＬＢ化?ｍｉｃｅ??各?？．?Ｎｕ舶?ｍｉｃｅ?３０夺?Ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ??弓?２０－?Ｖ??Ｓ１０－?／?＊?兰?２０－?／、、、??芒１?＾?多?／??３?：１?ｒ－＂－东二聋一??ｃｏｎｔｒｏｌ?２１?３０?Ｊ?＂?■??ａ）?Ｄａｙｓ?ａｆｔｅｒ?ＲＳＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ?°?ｃｏｎｔｒｏｌ?２＾?Ｔｏ￣??Ｄａｙｓ?ａ行ｅｒ?ＲＳＶ?ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ??７７??
?献医科大削壬研触学位论文???ｎ＝８，?Ａｐ＜〇．〇５，?ＡＡｐｃＯ．ｏｉ，?ＡＡＡｐ＜〇?Ｑ〇ｉ，?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ、ｖｉｔｈ?０化ｅｒ?ｇｒｏｕｐｓ；??ｂ＾Ｐ＜０．０５，?ｂ＾＾Ｐ＜０．０Ｉ，?ｂ＾＾＾Ｐ＜０．００１，?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ＲＳＶ＋ＲＥＳ?ｗｉｔｈ?ＲＳＶ?－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｎｕｄｅ?ｍｉｃｅ．??＊Ｐ＜０．０５，?＊＊Ｐ＜０．０１，?＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ?ｗｉｔｈ?ｏｔｈｅｒ?ｇｒｏｕｐｓ；?ａ＊Ｐ＜０．０５，??ａ＊＊Ｐ＜０．０１，?ａ＊＊＊Ｐ＜０．００１?ｃｏｍｐａｒｉｎｇ?ＲＳＶ＋ＲＥＳ?ｇｒｏｕｐ?ｗｉｔｈ?ＲＳＶ?－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＢＡＬＢ／ｃ?ｍｉｃｅ．??２．４．６白巧芦醇对ＲＳＶ感染后期ＴＲＩＦ表达的影响??如图３．２０所示，ＲＳＶ组裸鼠（ａ）肺组织中ＴＲＩＦ蛋白表达显著高于对照组（Ｐ??＜０．０５）及民ＳＶ＋ＲＥＳ?组（Ｐ＜０．０５）。ＲＳＶ?姐?ＢＡＬＢ／ｃ?小鼠（ｂ）肺组织中?ＴＲＩＰ??蛋白表达也豆著高于其对照组（Ｐ＜０．０１）及民ＳＶ＋ＲＥＳ组（Ｐ＜Ａ０１）。??
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