β-catenin对大鼠髋脱位关节软骨细胞增殖和凋亡影响的实验研究

发布时间：2017-08-06 11:19

  本文关键词：β-catenin对大鼠髋脱位关节软骨细胞增殖和凋亡影响的实验研究

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【摘要】：[背景和目的] 发育性髋关节脱位(Developmental dislocation of the hip, DDH)是小儿矫形外科最常见的疾病之一,由于早期筛查工作的开展,大部分患儿能获得及时的治疗,但仍有部分患儿在治疗过程中出现再脱位、残余髋发育不良(Residual acetabular Dysplasia RAD),以致成年后早期出现退行性骨关节炎(Osteoarthritis OA),最终进行全髋关节置换(Total hip arthroplasty, THA),降低了他们的生活质量。骨关节炎的实质是关节软骨发生退变,一般主要包括两方面,一方面细胞外基质的合成和降解代谢失衡；另一方面软骨细胞的增殖和凋亡发生变化。目前对于DDH早期发生关节软骨退行性变的细胞和分子机制仍不清楚。近来有研究表明β-catenin介导的Wnt通路在关节软骨的发育、增殖、分化、凋亡以及维持内环境的稳定等方面起着关键作用。本课题组在前期实验研究发现β-catenin对关节软骨起着双向调节的作用,主要表现对于正常软骨在早期关节发育阶段,β-catenin主要是激活促进关节软骨分化成熟,软骨发育成熟后β-catenin表达迅速降低；但在髋脱位关节软骨中随着发育成熟β-catenin的表达继续升高,促进了关节软骨发生退行性改变,推测关节软骨发生退变可能与β-catenin激活后导致X型胶原(Col X)以及基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase MMPs)的表达上调有关。正常情况下,软骨细胞是软骨组织内唯一的细胞类型,它在软骨基质损伤及重塑过程中对维持内环境的稳定起着重要作用,但在关节软骨退变过程中β-catenin对软骨细胞的增殖、凋亡的调控尚未见相关报道。因此,本文拟通过动物实验来模拟髋脱位的自然进程,探讨关节软骨在退变过程中β-catenin对软骨细胞增殖和凋亡的调控作用,为进一步深入研究DDH发生退变的分子机制提供新思路。 [方法] 1.60只新生Wistar大鼠随机分成实验组(n=30)和对照组(n=30),雌雄不限,体重均等。并按鼠龄分为2周龄组(n=10)、4周龄组(n=10)、8周龄组(n=10),对照组按照类似方法进行分组。实验组大鼠模拟襁褓体位采用医用胶带对双髋双膝伸直并拢固定10天制作髋脱位动物模型,然后去除外固定后继续饲养。每组达到预期时间进行取材进行实验。其中一侧髋关节经过固定、脱钙从冠状面剖开拍照存档用于测量臼深指数以及股骨头形态指数,然后制成切片进行番红O-固绿染色和β-catenin免疫组化染色,高倍镜下随机取五个不同视野观察组织形态变化以及β-catenin在不同时段关节软骨中的表达,并进行Mankin评分评估软骨退变程度。 2.另一侧髋关节用于提取关节软骨细胞进行原代培养,Ⅱ型胶原免疫荧光及甲苯胺蓝染色鉴定,采用CCK-8、流式分析细胞周期,检测两组在不同时段的增殖能力与凋亡情况； 3.对8周龄对照组贴壁软骨细胞进行LiCl干预,激活β-catenin表达,免疫荧光检测β-catenin;重复CCK-8、流式细胞分析检测软骨细胞的增殖能力、细胞周期以及凋亡的改变；TUNEL免疫荧光法检测凋亡率。 4.所有体外细胞实验均重复三次,数据以均数±标准差(X±SD)表示。采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,t检验进行统计学分析。P0.05为差异有统计学意义。 [结果] 1、动物模型制作以及大体形态观察：实验过程中,2周龄组松脱一只予以剔除,死亡一只。去除外固定后同笼喂养,大鼠体重与身长与对照组相比无明显差异。实验组的大体标本均可见股骨头脱出于髋臼外,证实建模成功(建模成功率93.3%)；且随着生长发育,股骨头未能获得复位,关节囊增厚,髋臼口变小,臼内有软组织嵌入,股骨头明显扁平,与髋臼严重不匹配。尽管实验组臼深指数以及股骨头形态指数显示较对照组发育小,但随鼠龄增加仍呈发育增大趋势；8周龄时髋臼发育基本停止,头臼不对称进一步加重(P0.05)。 2、病理组织形态观察以及Mankin评分：番红／固绿染色可见到对照组随着生长发育,关节软骨形态呈球形,且软骨层次清楚,逐渐变薄;实验组在4周龄关节软骨变形明显,浅层部分染色变浅,出现软骨细胞排列紊乱,局部聚集成簇、纤维化,8周龄时番红失染范围扩大,浅层软骨细胞消失,残留陷窝,可见较多裂隙,移行层细胞明显增生成簇。Mankin评分在2周龄时两组没有显著差异(P0.05),4、8周龄时实验组显著高于对照组(P=0.000),且实验组成逐渐上升趋势。P-catenin:免疫组织化学中可见β-catenin在对照组大鼠2周时表达较多,4周时表达明显增加,随鼠龄增长表达逐渐下降,8周时表达很弱；而在实验组β-catenin表达无下降趋势,且随着生长发育持续高表达。 3、体外细胞培养形态以及鉴定：软骨细胞培养及鉴定：软骨细胞培养后Ⅱ型胶原免疫荧光及甲苯胺蓝染色鉴定为软骨细胞。 4、不同时段软骨细胞增殖和凋亡的改变增殖速率在2周龄时：实验组(0.86)比对照组(0.75)快15.1%；4周龄时：实验组(1.14)比对照组(0.92)快24.6%;8周：实验组(0.78)比对照组(0.64)快21.8%。增殖指数：2周：对照组为30.4%,实验组44.9%,两者相比有显著统计学差异(P0.01)；4周：对照组为33.7%,实验组38.4%,两者之间有统计学差异(P0.05)；8周：对照组为22.4%,实验组26.4%,两者之间有统计学差异(P0.05)。凋亡率：2周：对照组22.1%,实验组55.1%,显著高于对照组(P0.01)。4周：对照组0.91%,实验组1.02%,两者之间无显著统计学差异(P0.05)。8周：对照组0.75%,实验组49.1%,显著高于对照组(P0.01)。 5、LiCl干预后软骨细胞增殖和凋亡的改变。LiCl激活β-catenin表达：8周龄正常贴壁软骨细胞加入LiCl后免疫荧光可见胞浆以及核内β-catenin表达明显增高,且以胞核内增多为主。干预后增殖速率(0.58)比干预前正常软骨细胞的增殖速率(0.64)下降了9%;与8周实验组增殖速率(0.78)相比,明显下降约25.6%。LiCl干预后增殖指数从22.4%下降至18.5%,有统计学差异(P0.05)；并明显低于8周实验组26.4%,有显著统计学差异(P0.01)；LiCl干预后凋亡率从0.75%上升至33.1%,有显著统计学差异(P0.01),但是显著低于8周实验组(49.1%P0.01)。 [结论] 1.新生大鼠髋关节固定十天,就可以成功制作髋脱位动物模型,在去除外固定后,髋关节不能恢复头臼匹配关系,随生长发育,会发生骨关节炎样病理改变。 2.在大鼠髋脱位关节软骨退变过程中,软骨细胞表现出较强的增殖能力和过高的凋亡率。 3.β-catenin高表达对成熟软骨细胞主要是抑制增殖而促进凋亡,可能是髋脱位发生退变的分子机制之一。
【关键词】：发育性髋关节脱位 动物模型 关节软骨 软骨退变 骨关节炎 β-连环蛋白(β-catenin) 免疫组化染色 细胞培养 细胞增殖、凋亡 细胞周期 氯化锂(LiCl) 免疫荧光
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R726.8
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 英文缩写词索引12-13
• 前言13-16
• 材料和方法16-24
• 一、DDH动物模型的制备及分组16
• 二、标本采集及处理16
• 三、实验试剂以及仪器16-17
• 四、主要实验方法和步骤17-23
• 五、实验数据统计23-24
• 结果24-39
• 一、 大体形态观察24-26
• 二、组织学观察26-28
• 三、软骨细胞的增殖活性和凋亡检测28-33
• 四、LiCl干预后软骨的增殖和阔亡改变33-39
• 讨论39-46
• 结论46-47
• 参考文献47-52
• 综述52-56
• 参考文献54-56
• 研究生期间完成论文56-57
• 致谢57-58

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本文编号：629637