重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用

发布时间：2017-08-25 11:36

  本文关键词：重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用

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【摘要】：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）感染可引起婴幼儿发生严重的毛细支气管炎、肺炎甚至死亡，也是诱发儿童哮喘的重要危险因素[1,2]。然而，目前治疗RSV感染尚无特异性抗病毒药物[3]，，探寻一种既安全又有效可用于预防和（或）治疗RSV感染的抗病毒药物仍旧迫切需要。 重组人干扰素α1b（recombinant human interferon-α1b, rhIFN-α1b）是一类由我国自主研制成功获得我国生产批文的基因工程类正规药品[4]，目前主要应用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及某些恶性肿瘤的治疗[5,6]，具有明显的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能。然而，关于rhIFN-α1b治疗儿童RSV感染仅限国内报道，缺乏正规统一的规范化治疗指南，且国内多位专家共识[7]认为“α-干扰素作为抗病毒治疗常用药物，已有临床使用经验，但尚无儿童雾化吸入推荐剂量，其有效性也需进一步证实”。 本科RSV系列实验前期研究了rhIFN-α1b雾化吸入对RSV感染小鼠的作用[8]以及小儿病毒性肺炎患儿肌内注射rhIFN-α1b的安全性和耐受性[4]。前者研究发现雾化吸入rhIFN-α1b12μg对RSV感染小鼠治疗有效[8]，后者研究发现在0.3~2.0μg/kg范围内肌内注射rhIFN-α1b对于小儿病毒性肺炎恢复期患儿耐受性良好，无明显毒副作用[4]。因此，本实验研究rhIFN-α1b多剂量、大剂量雾化吸入对RSV感染小鼠的作用，试图进一步探讨rhIFN-α1b对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用。 目的： 本实验旨在采用rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入和rhIFN-α1b腹腔注射两种方式对RSV感染小鼠进行干预，通过光镜和透射电镜观察肺组织病变，荧光定量RT-PCR检测肺组织RSV病毒载量，流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群和ELISA方法检测血清细胞因子水平的方法，探讨rhIFN-α1b对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用，为rhIFN-α1b治疗儿童呼吸道RSV感染的临床用药提供一定的实验依据。 方法： 1)培养Hep-2细胞，增殖RSV，收集病毒液。 2)提取病毒液RNA，荧光定量RT-PCR进行鉴定。 3)鉴定其为RSV后，测定病毒滴度TCID50。 4)将BALB/c小鼠随机分为10组，每组10只，分别为空白对照组（1组）、阴性对照组（1组）、RSV感染模型组（1组）、rhIFN-α1b（3.125μg、12.5μg、25μg、50μg）雾化吸入组（4组）、利巴韦林雾化吸入组（1组）、rhIFN-α1b腹腔注射组（1组）、利巴韦林腹腔注射组（1组）。 5) RSV病毒液滴鼻，成功建立RSV感染小鼠模型后，按照分组连续给予各组小鼠（雾化吸入或腹腔注射）干预治疗5天（空白对照组除外）。 6)于次日采集小鼠全血，流式细胞术检测CD3+CD4+与CD3+CD8+水平，计算两者比值。 7)分离小鼠血清，ELISA检测IFN-γ、IL-4、IL-17水平。 8)剖取小鼠肺组织，制作HE染色切片，光镜下观察小鼠肺组织病理学改变，计算组织病理学评分。 9)制作电镜超薄切片，透射电镜下观察小鼠肺组织超微结构改变。 10)荧光定量RT-PCR检测小鼠肺组织RSV病毒载量。 11)统计学分析。 结果： 1) Hep-2细胞培养及RSV增殖过程顺利。 2)荧光定量RT-PCR建立标准曲线：斜率-2.62，Y轴截距39.5，相关系数0.990，基线范围6~15，阈值0.16，即得到标准曲线方程式Y=-2.62X+39.5。病毒液核酸检测结果阳性，鉴定其为RSV，可用于后续实验。 3)根据Reed-Muench公式，计算得出RSV病毒液TCID50=10-4.6。 4) RSV感染小鼠表现为不同程度的精神萎靡，运动迟缓，饮食减少，呼吸急促，毛发竖立无光泽，部分表现有咳嗽及打喷嚏症状，提示RSV感染小鼠模型建立成功。 5)光镜下可见RSV感染模型组小鼠肺组织支气管与细支气管周大量淋巴细胞浸润，管腔内大量分泌物渗出，肺泡隔显著增宽，肺泡腔狭窄或消失，肺泡腔内可见红细胞及淡红色透明水肿液。RSV感染模型组小鼠肺组织病理学评分（24.600分±1.342分）与阴性对照组（1.600分±2.191分）和空白对照组（0.800分±1.789分）比较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入组可见，随着雾化吸入剂量的倍增，小鼠肺组织炎性损伤程度下降，肺组织病理学评分呈递减趋势，4个剂量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），与RSV感染模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），rhIFN-α1b3.125μg雾化吸入组除外。利巴韦林雾化吸入组小鼠肺组织炎性损伤程度较rhIFN-α1b25μg雾化吸入组严重，利巴韦林腹腔注射组比rhIFN-α1b腹腔注射组肺组织炎性损伤程度略重。 6)透射电镜下可见RSV感染模型组小鼠肺泡隔显著增厚，充血、出血、水肿明显，部分有肺实变表现，肺泡腔缩小或消失，腔内可见红细胞与坏死、脱落的细胞碎片等；Ⅰ型肺泡上皮细胞为早期凋亡表现，胞核异形改变，核染色质边集凝聚，胞质内吞饮小泡数量明显降低，次级溶酶体数量增多，线粒体数量减少，细胞表面微绒毛变性坏死，杂乱分布，胶原成分形成，细胞连接疏松，部分已经完全脱落；Ⅱ型肺泡上皮细胞少有早期凋亡表现，胞核变化不大，胞质内线粒体数量增多，嗜锇性板层小体数量增多，分泌、胞吐现象活跃。rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入组可见，小鼠肺组织炎性损伤程度明显减轻。利巴韦林雾化吸入组可见程度不一的高电子密度致密物沉积现象，连接成线状或带状均匀分布于肺泡隔基底膜区域，而rhIFN-α1b雾化吸入组与2个腹腔注射组均未观察到此类现象。 7)荧光定量RT-PCR检测结果显示阴性对照组与空白对照组小鼠肺组织未检出RSV，RSV感染模型组小鼠肺组织RSV病毒载量最高(153.706±18.982) copies/mg，与其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），rhIFN-α1b3.125μg雾化吸入组与利巴韦林腹腔注射组除外。rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入组结果显示，随着雾化吸入剂量的倍增，小鼠肺组织RSV病毒载量呈递减趋势，rhIFN-α1b25μg雾化吸入组与rhIFN-α1b50μg雾化吸入组抗病毒作用显著，与其余各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。rhIFN-α1b腹腔注射组与利巴韦林腹腔注射组小鼠肺组织RSV病毒载量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 8)流式细胞术检测结果显示RSV感染模型组小鼠外周血CD3+CD4+水平（78.820%±0.973%）最高，CD3+CD8+水平（18.020%±1.628%）最低，两者比值（4.404±0.415）显著升高，与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入组结果显示，随着雾化吸入剂量的倍增，小鼠外周血CD3+CD4+水平逐渐下降，CD3+CD8+水平逐渐回升，两者比值降低，rhIFN-α1b50μg雾化吸入组与其余各药物干预组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），rhIFN-α1b25μg雾化吸入组除外。rhIFN-α1b腹腔注射组与利巴韦林腹腔注射组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 9) ELISA检测结果显示RSV感染模型组小鼠血清IFN-γ水平最低（39.386pg/mL±11.942pg/mL），IL-4（131.241pg/mL±15.388pg/mL）与IL-17（132.080pg/mL±17.659pg/mL）水平最高，与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入组结果显示，随着雾化吸入剂量的倍增，小鼠血清IFNγ水平逐渐回升，IL-4与IL-17水平逐渐下降，rhIFN-α1b50μg雾化吸入组与其余组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。rhIFN-α1b腹腔注射组与利巴韦林腹腔注射组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论： 1) rhIFN-α1b雾化吸入对RSV感染小鼠肺组织病毒载量具有良好的抑制作用。 2) rhIFN-α1b雾化吸入对RSV感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群失衡具有良好的调节作用。 3) rhIFN-α1b雾化吸入对RSV感染小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平具有良好的调节作用。 4) rhIFN-α1b不同剂量雾化吸入对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用存在一定的剂量-效应关系。 5) rhIFN-α1b50μg雾化吸入对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用最佳，强于利巴韦林雾化吸入与rhIFN-α1b腹腔注射。 6) rhIFN-α1b腹腔注射与利巴韦林腹腔注射对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用未见明显差异。 7)首次研究rhIFN-α1b多剂量、大剂量雾化吸入对RSV感染小鼠的抗病毒及免疫调节作用，并与rhIFN-α1b腹腔注射进行疗效对比，为rhIFN-α1b治疗RSV感染的进一步临床应用研究奠定了实验基础。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 重组人干扰素α1b 雾化吸入 组织病理学 T淋巴细胞亚群 细胞因子 小鼠
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-18
• 前言18-19
• 文献回顾19-27
• 第一部分 重组人干扰素α1b 对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织病变的影响27-53
• 1 材料27-30
• 2 方法30-40
• 3 结果40-50
• 4 讨论50-53
• 第二部分 重组人干扰素α1b 对呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群的影响53-61
• 1 材料53-54
• 2 方法54-55
• 3 结果55-59
• 4 讨论59-61
• 第三部分 重组人干扰素α1b 对呼吸道合胞病毒感染小鼠血清 IFN-γ、IL-4、IL-17 水平的影响61-73
• 1 材料61-62
• 2 方法62-64
• 3 结果64-70
• 4 讨论70-73
• 小结73-74
• 参考文献74-87
• 个人简历和研究成果87-88
• 致谢88-89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 韩琳;裴毅;;恶性肿瘤患者外周血中CTL、Ts细胞绝对数值的变化及临床意义分析[J];现代生物医学进展;2007年04期

2 徐军;胡云章;;呼吸道合胞病毒疫苗研究进展[J];生物技术通讯;2007年02期

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4 黄凤;张学兰;季伟;;急性呼吸道感染儿童中呼吸道合胞病毒的监测及临床意义[J];苏州大学学报(医学版);2009年04期

5 张竞;阎浩林;梅兴国;;呼吸道合胞病毒(RSV)与Th1/Th2细胞因子的关系研究进展[J];沈阳药科大学学报;2008年12期

本文编号：736701