协同信号分子B7-H3对肺炎链球菌脑膜炎小鼠脑损伤的影响

发布时间：2017-08-28 07:30

  本文关键词：协同信号分子B7-H3对肺炎链球菌脑膜炎小鼠脑损伤的影响

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【摘要】：实验目的： 细菌性脑膜炎是儿童时期较严重的中枢神经系统感染性疾病，近年来，尽管给予有效的抗生素治疗，但是细菌性脑膜炎仍有较高的死亡率和致残率，因此进一步研究细菌性脑膜炎的免疫病理机制，寻找新的免疫干预手段意义重大。细菌性脑膜炎导致血脑屏障破坏和脑组织损伤，而脑组织损伤的严重程度决定了细菌性脑膜炎患者的预后。有诸多研究已证实在细菌性脑膜炎时脑内神经元会发生坏死、凋亡等改变。神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）和S100b已经被证实是脑损伤的特异性标志物，诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）能够生物合成(nitric oxide,NO)，它已经被证实在细菌性脑膜炎引起的神经细胞凋亡中扮演者重要角色。协同信号分子是介导抗感染免疫应答过程的重要成分，B7同源性3（B7Homology3，B7-H3）是B7家族的新成员，它在抗感染免疫应答中发挥着重要的免疫调控作用。我们前期研究发现细菌性脑膜炎患儿体内可溶性B7-H3分子异常高表达，此外还发现在小鼠肺炎链球菌（S. Pneumoniae，SP）脑膜炎模型中B7-H3加剧了SP脑膜炎的病理损伤（血脑屏障的破坏），增强了炎症趋化作用。本研究是在以上前期工作的基础上进一步观察分析B7-H3对细菌性脑膜炎动物模型脑组织中神经元坏死、脑细胞凋亡的影响，以及对脑损伤标志物NSE、S100b、iNOS表达的影响，探讨B7-H3对细菌性脑膜炎小鼠脑损伤的影响，了解其在细菌性脑膜炎病情进展中的作用，以期为细菌性脑膜炎的免疫干预提供新的思路和实验依据。 实验方法： 1、研究B7-H3对SP脑膜炎小鼠神经行为学改变、体质量的变化的影响，取月龄为1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，随机分为4组：生理盐水对照组（CON组）、B7-H3组（B7-H3组）、肺炎链球菌组（SP组）、肺炎链球菌+B7-H3蛋白组（SP+B7-H3组）；每组12只小鼠。腹腔注射诱导麻醉后，通过侧脑室定位注入10ul无菌生理盐水+5ul肺炎链球菌混悬液来建立小鼠细菌性脑膜炎模型；CON组注射15ul无菌生理盐水，B7-H3组注入10ul浓度为0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul无菌生理盐水，SP组注入10ul无菌生理盐水+5ul肺炎链球菌混悬液，SP+B7-H3组注入10ul浓度为0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul肺炎链球菌混悬液。 2、分别于侧脑室注射后18h、48h、72h对各组小鼠进行：1）神经行为学评分、2）记录体质量的变化（分别记录注射前后在不同时间点小鼠的体重，分析前后体重差值的变化）。研究B7-H3对SP脑膜炎小鼠脑组织中神经细胞丢失（Nissl染色）和脑组织细胞凋亡（Tunel染色）的影响，评价脑损伤情况。关于动物模型及分组同实验方法1.分别于侧脑室注射后18h、48h、72h检测小鼠脑组织中神经细胞的丢失和凋亡。(通过显微镜观察不同时间点小鼠脑组织中尼氏染色阳性细胞及凋亡阳性细胞数量的改变）。 3、分析B7-H3对SP脑膜炎小鼠脑组织匀浆中脑损伤标志物NSE，S100b mRNA相对表达量及NSE,S100b,iNOS蛋白表达的影响，关于动物模型及分组同实验方法1。分别于侧脑室注射后18h、48h、72h对小鼠进行1）Real-time PCR方法检测脑组织匀浆中脑损伤标志物NSE,S100b mRNA的相对表达量、2）免疫组织化学方法检测脑组织中NSE,S100b,iNOS蛋白的表达。 实验结果： 一、B7-H3对SP脑膜炎小鼠临床症状的影响 1、神经行为学评分：分别记录各组小鼠侧脑室注射后18h、48h、72h时的临床评分。B7-H3组与CON组小鼠临床评分：18h（5.0±0）vs（5.0±0）、48h（5.0±0）vs（5.0±0）、72h（5.0±0）vs（5.0±0），差异均无统计学意义（P0.05）；SP组在18h、48h、72h临床评分较CON组均明显降低：18h（4.5±0.57）vs（5.0±0）、48h（3.5±0.57）vs（5.0±0）、72h（2.75±0.5）vs（5.0±0），差异具有统计学意义（P0.05）；SP+B7-H3组在18h、48h、72h临床评分均明显低于CON组：18h（4.0±0）vs（5.0±0）、48h（3.0±0）vs（5.0±0）、72h（1.75±0.5）vs（5.0±0），差异具有统计学意义（P0.01），且SP+B7-H3组与SP组相比进一步降低：18h（4.0±0）vs（4.5±0.57）、48h（3.0±0）vs（3.5±0.57）、72h（1.75±0.5）vs（2.75±0.5），差异具有统计学意义（P0.05）。 2、体质量变化：分别记录各组小鼠侧脑室注射前和注射后18h、48h、72h体质量的变化。B7-H3组与CON组小鼠在18h、48h、72h体质量变化：18h（-0.01±0.24）vs（-0.05±0.42）、48h（-0.02±0.12）vs（-0.28±0.34）、72h（-0.02±0.13）vs（-0.07±0.4），两组间体质量变化无显著差异（P0.05）；SP组接种细菌后18h、48h、72h时体重相对于CON组均降低：18h（0.8±0）vs（-0.05±0.42）、48h（1.48±0.05）vs（-0.28±0.34）、72h（2.53±0.07）vs（-0.07±0.4），差异均具有统计学意义（P0.05）；SP+B7-H3组小鼠在接种细菌和蛋白混悬液后体重明显低于CON组：18h（1.5±0.17）vs（-0.05±0.42）、48h（2.0±0.02）vs（-0.28±0.34）、72h（3.23±0.12）vs（-0.07±0.4）（P0.05），SP+B7-H3组与SP组相比亦明显降低：18h（1.5±0.17）vs（0.8±0）、48h（2.0±0.02）vs（1.48±0.05）、72h（3.23±0.12）vs（2.53±0.07），差异均具有统计学意义（P0.05）。 二、B7-H3对SP脑膜炎小鼠脑组织中神经细胞的坏死和凋亡的影响。 1、Nissl染色四组小鼠脑组织中均有染色阳性的细胞,在脑组织中，B7-H3组尼氏染色阳性的神经元细胞与CON组比较无明显差异18h（113.33±5.77）vs（115.0±5.0）、48h（113.0±1.0）vs（113.0±2.65）、72h（108.67±3.21）vs（107.67±3.21），差异无统计学意义（P0.05）；SP组与CON组比较阳性细胞数量减少18h（105.0±5.0）vs（115.0±5.0）、48h（94.33±4.04）vs（113.0±2.65）、72h（89.33±0.58）vs（107.67±3.21），差异具有统计学意义（P0.05）；SP+B7-H3组18h、48h、72h与CON组比较明显降低18h（90.0±1.0）vs（115.0±5.0），48h（82.0±2.65）vs（113.0±2.65）、72h（81.33±2.31）vs（107.67±3.21），差异具有显著性（P0.01）；同时还发现，在18h、48h、72h三个时间点SP+B7-H3组阳性细胞数目均低于SP组（90.0±1.0）vs（105.0±5.0）、（82.0±2.65）vs（94.33±4.04）、72h（81.33±2.31）vs（89.33±0.58），差异有统计学意义（P0.05）。 2、Tunel染色在脑组织中，B7-H3组Tunel染色阳性的凋亡细胞与CON组比较无明显差异18h（0.67±0.57）vs（1.33±0.57）、48h（0.68±0.57）vs（0.67±0.58）、72h（1.0±1.0）vs（0.33±0.58），差异无统计学意义（P0.05）；SP组与CON组比较凋亡细胞增多18h（11.33±1.53）vs（1.33±0.57）、48h（19.0±1.0）vs（0.67±0.58）、72h（26.32±1.54）vs（0.33±0.58），差异具有显著性（P0.01）；SP+B7-H3组18h、48h、72h与CON组比较凋亡细胞增多更明显18h（17.67±2.08）vs（1.33±0.57），48h（26.33±1.53）vs（0.67±0.58）、72h（38.0±2.65）vs（0.33±0.58），差异具有统计学意义（P0.01）；同时发现在18h、48h、72h三个时间点SP+B7-H3与SP组比较凋亡细胞亦增多18h（17.67±2.08）vs（11.33±1.53），48h（26.33±1.53）vs（19.0±1.0）、72h（38.00±2.65）vs（26.32±1.54）（P0.05）。 三、B7-H3对SP脑膜炎小鼠脑组织中脑损伤标志物及iNOS的影响 1、Real-time PCR检测脑组织匀浆中NSE，S100b mRNA的相对表达量：我们发现在细菌注射18h、48h、72h后，B7-H3组和CON组的NSE mRNA表达，18h（0.052±0.034）vs（0.028±0.01）、48h（0.02±0.001）vs（0.028±0.003）、72h（0.036±0.002）vs（0.028±0.001），差异均无统计学意义（P0.05）；细菌注射后18h时NSEmRNA相对表达量，SP组较CON组明显升高（0.095±0.03）vs（0.028±0.01），差异有统计学意义（P0.05）； SP+B7-H3组较SP组明显升高（0.124±0.049）vs（0.095±0.03），差异具有统计学意义（P0.05）。细菌注射后48h时NSE mRNA相对表达量，SP组较CON组明显升高（0.177±0.021）vs（0.028±0.003），差异具有统计学意义（P0.05），SP+B7-H3组较SP组明显升高（0.33±0.088）v（s0.177±0.021），差异具有统计学意义（P0.05）；细菌注射后72h时NSE mRNA相对表达量，SP组较CON组明显升高（0.369±0.035）v（s0.028±0.001），差异具有统计学意义（P0.05），SP+B7-H3组较SP组明显升高（0.529±0.02）vs（0.369±0.035），差异具有统计学意义（P0.05）。 在细菌注射后B7-H3组和CON组的S100bmRNA表达，18h（0.04±0.018）vs（0.03±0.006）、48h（0.029±0.003）vs（0.029±0.002）、72h（0.048±0.001）vs（0.046±0.002），差别无统计学意义（P0.05）；细菌注射后18h时S100b mRNA相对表达量，SP组较CON组升高（0.061±.006）vs（0.03±0.006），差异有统计学意义（P0.05），SP+B7-H3组较SP组升高（0.148±0.052）vs（0.061±.006），差异有统计学意义（P0.05）；细菌注射后48h时S100b mRNA的相对表达量，SP组较CON组升高（0.185±0.012）vs（0.029±0.002），差异具有统计学意义（P0.05），SP+B7-H3组较SP组升高（0.194±0.018）vs（0.185±0.012），差异具有统计学意义（P0.05）；细菌注射后72h时S100b mRNA的相对表达量，SP组较CON组明显升高（0.284±0.008）vs（0.046±0.002），差异具有统计学意义（P0.05），SP+B7-H3组较SP组明显升高（1.62±0.118）vs（0.284±0.008），差异具有统计学意义（P0.05）。 2、脑组织免疫组织化学结果分析： 2.1脑组织中NSE蛋白的表达：在脑组织中，各组小鼠均有NSE阳性细胞表达，光镜下为胞内基质有棕褐色颗粒沉积。我们发现在细菌注射后18h、48h、72h，B7-H3组与CON组比较NSE阳性细胞数目无明显差异：18h（100.0±4.58）vs（99.67±0.58）、48h（100.33±0.58）vs（99.66±2.08）、72h（99.67±2.31）vs（100.0±2.0），差异无统计学意义，（P0.05）；SP组NSE阳性细胞数与CON组比较明显减少18h（96.67±1.53）vs（99.67±0.58）、48h（82.0±2.65）vs（99.66±2.08）、72h（75.33±0.58）vs（100.0±2.0），差异有统计学意义（P0.05）。SP+B7-H3组NSE阳性细胞数与CON组比较在18h、48h、72h三个时间点均明显减少（86.67±2.89）vs（99.67±0.58）、（66.0±5.29）vs（99.66±2.08）、（55.0±5.0）vs（100.0±2.0），差异具有显著性（P0.01）。同时我们还发现，在18h、48h、72h三个时间点SP+B7-H3组NSE阳性细胞数目均少于SP组（86.67±2.89）vs（96.67±1.53）、（66.0±5.29）vs（82.0±2.65）、（55.0±5.0）vs（75.33±0.58），差异具有显著性（P0.05）。 2.2脑组织中S100b蛋白的表达：在脑组织中，各组小鼠均有S100b阳性细胞表达。在B7-H3组、CON组18h、48h、72h均出现S100b免疫组化反应阳性，但阳性细胞数无明显差异18h（23.45±1.98）vs（23.54±2.3）、48h（23.67±2.32）vs（23.53±2.12）、72h（23.78±2.34）vs（23.76±1.32）（P0.05），差异无统计学意义（P0.05）；SP组S100b表达较CON组明显升高，18h（30.1±3.21）vs（23.54±2.3）、48h（38.23±3.23）vs（23.53±2.12）、72h（43.12±1.33）vs（23.76±1.32），差异均具有统计学意义（P0.05）；SP+B7-H3组S100b表达与CON组比较升高更明显18h（40.6±1.45）vs（23.54±2.3）、48h（55.34±1.53）vs（23.53±2.12）、72h（68.12±2.89）vs（23.76±1.32），差异具有显著性（P0.01）；同时我们还发现，在18h、48h、72h三个时间点，SP+B7-H3组S100b表达均高于SP组，18h（40.6±1.45）vs（30.1±3.21）、48h（55.34±1.53）vs（38.23±3.23）、72h（68.12±2.89）vs（43.12±1.33），（P0.05）。 2.3脑组织中iNOS蛋白的表达：在脑组织中，用PBS替代一抗作为阴性对照，阴性对照未见免疫组化iNOS阳性染色颗粒；B7-H3组与CON组几乎都无iNOS的表达。SP组iNOS表达与CON组比较明显升高，18h（29.33±1.15）vs（0.0±0.0）、48h（45.0±5.0）v（s1.0±0.0）、72h（71.67±2.89）v（s0.0±0.0），差异均具有统计学意义（P0.05）；SP+B7-H3组iNOS表达较CON组升高更明显，18h（35.33±0.58）vs（0.0±0.0）、48h（56.33±1.53）vs（1.0±0.0）、72h（81.67±2.89）vs（0.0±0.0），差异均具有显著性（P0.01）；同时我们还发现，在18h、48h、72h三个时间点SP+B7-H3组iNOS表达均高于SP组，18h（35.33±0.58）vs（29.33±1.15）、48h（56.33±1.53）vs（45.0±5.0）、72h（81.67±2.89）vs（71.67±2.89），差异均具有显著性（P0.05）。 结论： 1、本实验经侧脑室注射肺炎链球菌混悬液，成功建立了小鼠SP脑膜炎模型。 2、本实验结果显示：在SP脑膜炎模型中，小鼠临床评分降低，体重减轻，脑组织中Nissl染色阳性的神经元细胞减少，Tunel染色阳性凋亡细胞增多；脑损伤标志物分子NSE，S100b mRNA相对表达量及S100b，iNOS蛋白表达量升高，NSE蛋白阳性细胞在脑组织中减少，这些结果表明，SP脑膜炎小鼠模型发生了脑损伤。 3、协同信号分子B7-H3加剧了SP脑膜炎的临床症状，促进了脑组织神经细胞丢失、凋亡（Nissl染色阳性的神经元细胞减少更明显，，Tunel染色阳性凋亡细胞进一步增多）；并且使NSE、S100bmRNA的相对表达量和S100b、iNOS蛋白表达进一步升高，NSE蛋白阳性细胞进一步减少，表明B7-H3加剧了SP脑膜炎引起的脑损伤。
【关键词】：B7-H3 SP脑膜炎 NSE S100b iNOS 脑损伤
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 中文摘要4-10
• Abstract10-18
• 引言18-23
• 参考文献20-23
• 第一部分 B7-H3 对 SP 脑膜炎小鼠临床症状（体质量变化、神经行为学改变）的影响23-30
• 材料与方法23-27
• 实验结果27-30
• 第二部分 B7-H3 对 SP 脑膜炎小鼠脑组织神经细胞坏死（NISSL 染色）和凋亡（TUNEL 染色）的影响30-40
• 材料与方法30-35
• 实验结果35-40
• 第三部分 B7-H3 对 SP 脑膜炎小鼠脑组织中脑损伤标志物 NSE、S100B 及 INOS 的影响40-55
• 材料与方法40-46
• 实验结果46-55
• 讨论55-62
• 参考文献62-68
• 实验结论68-69
• 综述69-77
• 参考文献74-77
• 中英文对照缩略词表77-78
• 攻读学位期间公开发表的论文78-79
• 本课题支助项目79-80
• 致谢80-81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 赵建祥;贺华;马建芳;卞留贯;孙青芳;沈建康;;饥饿诱导胶质瘤细胞自噬发生及Beclin-1表达的变化[J];第二军医大学学报;2010年09期

2 陈仁辉,李永宏,蔡红星,吴茂旺,汪枫;大鼠弥漫性脑损伤后早期病理学及烯醇化酶表达[J];中国法医学杂志;2005年05期

3 曹旭东,孔令洪,王一理;B7家族新成员[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年04期

4 洪远;郭松雪;张建民;;自噬在创伤性脑损伤中的作用[J];中国病理生理杂志;2011年08期

5 谷兴华;张供;张希全;宋毅;王涛;李守先;;血清蛋白B亚型和神经元特异性烯醇化酶对早期判断体外循环术后脑损伤的意义[J];中华医学杂志;2007年14期

6 杜鹏;木依提;栾新平;贾宏宇;苑杨;徐敬轩;张晶晶;;外伤性癫痫模型海马中自噬变化动态研究[J];新疆医学;2013年09期

本文编号：747510