叶酸靶向相变载金高分子超声及光声造影剂的基础研究

发布时间：2018-11-25 08:37

【摘要】：第一部分叶酸靶向高分子材料的制备和鉴定目的制备叶酸靶向的聚乳酸-羟基乙酸/聚乙二醇高分子材料(PLGA-PEG-FA),建立制备关键步骤过程控制的检测方法并鉴定其化学结构,检测其体外靶向的特异性。方法采用五步法制备PLGA-PEG-FA: ①合成PLGA-NHS: ②合成单氨基保护的NH2-PEG-BOC； ③PLGA.NHS与PEG连接； ④PLGA-PEG-NH-BOC氨基脱保护,得PLGA-PEG-NH2； ⑤PLGA-PEG-FA的合成。以薄层层析法和核磁共振氢谱监控合成的关键过程,以核磁共振氢谱对终产品PLGA-PEG-FA进行结构确证,用流式细胞技术检测体外靶向特异性。结果 ①PLGA-NHS的核磁共振氢谱可见在化学位移值为2.6ppm处形成一新峰,与NHS的亚甲基峰一致。氢谱结果表明PLGA-NHS结构正确,NHS成功的置换了原PLGA上的羧基； ②薄层层析结果：阳性对照PEG和PLGA-PEG-NH2展开后均显色非常明显,提示PEG已通过化学键和PLGA成功连接； ③PLGA-PEG-FA聚合物用核磁共振氢谱进行结构鉴定其结构正确； ④流式细胞检测到随着PLGA-PEG-FA的量增加,SKOV3阳性细胞数大幅增加,达一定浓度时,已达到饱和(接近100%),阳性细胞数不再增加,结合呈“S”型曲线,符合受体和配体结合规律。当先加入不同浓度的FA和SKOV3共同孵育后,随着FA浓度的增加,阳性细胞数迅速减少,当FA达到一定量后,已经检测不到阳性细胞。提示FA竞争性抑制了PLGA-PEG-FA与SKOV3上FR的结合。结论 ①成功制备PLGA-PEG-FA高分子材料,纯度98%,结构正确,可特异性和细胞上FR结合； ②成功建立了PLGA-PEG-FA的制备方法,过程可控,获得重要的过程控制参数； ③核磁共振氢谱和薄层层析法可用与NHS活化和PEG连接两步关键步骤的过程控制； ④为制备叶酸靶向相变载金高分子造影剂奠定了坚实基础。第二部分叶酸靶向相变载金高分子超声及光声造影剂的制备及其性质研究目的利用第一部分已成功制备的叶酸靶向高分子材料(PLGA-PEG-FA)包裹全氟戊烷(PFP)和纳米金(GNP),制备叶酸靶向相变载金高分子超声和光声造影剂(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)建立并优化制备方法,检测高分子超声和光声造影剂的物理学特性和体外靶向的特异性。方法 ①制备相变型造影剂：双乳化法制备分别包裹PFP和全氟己烷(PFH)的纳米造影剂,采用精密恒温控制器加热、水浴及低强度聚焦超声三种方法观察两种造影剂相变的条件,从而确定选用PFP或PFH作为相变造影剂的内核； ②制备叶酸靶向相变载金高分子造影剂：在成功制备相变型造影剂的基础上,采用双乳化法制备叶酸靶向相变载金高分子造影剂。用精密恒温控制器逐步加温,光学显微镜下实时观察相变情况,比较载金与不载金高分子造影剂相变温度的差异、高强度聚集超声促发相变的差异以及激光辐照激发相变的差异； ③优化GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影剂制备条件：采用破坏微球法,测定包裹量,根据包裹量确定PFP和PLGA-PEG-FA最佳质量比；采用激光辐照后光镜下观察相变产生气泡量确定GNP和PLGA-PEG-FA最佳质量比； ④GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子超声和光声造影剂的一般理化性质检测：包括浓度、pH计、扫描电镜、投射电镜、粒径、电位；采用流式细胞技术检测其体外靶向特异性。结果 ①两种相变型纳米造影剂PFP/PLGA-PEG-FA和PFH/PLGA-PEG-FA在常规二维超声下表现均为密集点状高回声,分布均匀。粒径分布集中,呈单峰。前者恒温控制器加温和水浴的相变温度分为43℃和42℃,后者分别为71℃和68℃；LIFU均可促发二者相变,但前者相变需要的能量更低； ②载金后的相变型造影剂(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)与非载金(PFP/PLGA-PEG-FA)(?)匕较,相变温度无明显差异；高强度聚集超声(HIFU)可激发二者相变,激发强度无明显差异；激光辐照后,前者可发生相变,而后者不发生相变。温度、HIFU和激光辐照均不能激发只载金的造影剂(GNP/H20/PLGA-PEG-FA)发生相变； ③PFP和PLGA的最佳质量比约为11：1时,包裹率最高；GNP和PLGA的质量比约为1：12.5时,激光辐照后,相变最强； ④一般理化特性：外观呈棕黑色混悬液；浓度为3.657x1015个/ml；pH值为7.12；粒径为(268.1±90.87)mn,Zeta电位为(-67.6+12.7)mV。扫描电镜下呈球形,形态规则,大小尚均匀,分散度好；透射电镜下可见纳米金呈不规则团片状颗粒样不均匀地分布于纳米粒上； ⑤流式细胞检测：随着GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影剂量的增加,细胞膜上表达FR的SKOV3和HL-60细胞的阳性细胞数大幅增加,当加入的量到达一定浓度时,阳性细胞数不再增加,结合呈“S”型曲线,符合受体和配体结合规律。不表达FR的Wish(?)田胞始终未检测到阳性细胞。当先加入不同浓度的FA和SKOV3共同孵育后,随着FA浓度的增加,阳性细胞数迅速减少,当FA达到一定量后,已经检测不到阳性细胞。结论 ①以PLGA-PEG-FA为膜材包裹后,PFP的相变条件比PFH更接近生理条件,选择PFP为相变材料可兼顾诊断与治疗的需求； ②载GNP后,不影响温度和声致相变的条件,增加了光致相变的特性,使本造影剂具有多模态显像的潜力； ③一般理化性质表明GNP/PFP/PLGA-PEG-FA高分子造影剂为形态规则,大小均匀的纳米微球； ④本造影剂可与两种高表达不同FR亚型的细胞结合,FA可竞争性抑制这种结合,而与不表达FR的细胞不结合,均提示本造影剂与FR特异性结合； ⑤温度、HIUF、LIUF以及激光均可激发GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相变。即本造影剂具备超声造影剂和光声造影剂的特性； ⑥以上提示本研究成功的制备了叶酸靶向相变载金高分子超声和光声造影剂(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)。第三部分叶酸靶向相变载金高分子超声及光声造影剂增强超声显像的研究目的研究叶酸靶向相变载金高分子超声及光声造影剂(GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)在体内、外通过声致相变和光致相变后增强超声显像的作用。方法 ①体外声致相变和光致相变后增强超声显像的作用。实验分为GNP/PFP/PLGA-PEG-FA组,以GNP/H2O/PLGA-PEG-FA为对照；PFP/PLGA-PEG-FA组,以H0O/PLGA-PEG-FA为对照。分别采用LIFU作用和激光辐照,观察LIFU和激光作用前后的基波和谐波超声显像； ②离体组织中声致相变和光致相变后增强超声显像的作用。分别采用局部注射与灌注两种方式,在离体猪肝上观察GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA造影剂在LIFU作用和激光辐照后基波和谐波超声显像,同时观察超声造影剂声诺维的离体组织灌注表现； ③以SKOV3裸鼠荷瘤模型研究造影剂在体内声致相变和光致相变后增强肿瘤超声显像的作用。实验分为GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA两个实验组,以超声造影剂声诺维为对照。采用腹腔注射。声诺维注射前后观察肿瘤内造影剂进入及消退的过程。两实验组分别在腹腔注射后即刻、20mmin、2h和4h采用LIFU作用和激光辐照,每次作用前后观察肿瘤的基波和谐波超声显像。结果 ①LIFU作用后,含有液态氟碳PFP的两种造影剂：GNP/PFP/PLGA-PEG-FA及PFP/PLGA-PEG-FA在谐波模式下可见到较多点状高回声出现,而不含液态氟碳的两种造影剂：GNP/H2O/PLGA-PEG-FA及H2O/PLGA-PEG-FA超声基波与谐波模式图像均无明显改变。激光辐照后,仅载金的造影剂(即GNP/PFP/PLGA-PEG-FA)在谐波模式下可见到较多点状高回声出现。而其他三种不载金的造影剂超声图像均无明显改变； ②离体局部注射两种GNP/PFP/PLGA-PEG-FA和PFP/PLGA-PEG-FA造影剂后,以LIFU及激光促发,结果与体外实验完全一致。离体肝脏组织局部灌注声诺维后,谐波下可观察到造影剂的增强回声分布于肝实质并达肝包膜下方。两种自制造影剂灌注结束后,该区域的肝实质在基波下回声增强不明显,谐波下未见明显显像。LIFU作用于灌注区域后,作用区域基波及谐波下回声均增强,谐波下回声增强更明显。激光辐照后,仅有GNP/PFP/PLGA-PEG-FA组作用区域基波及谐波下回声均增强,谐波下回声增强更明显； ③腹腔注射声诺维后,在造影模式下,约30S左右时可见肿瘤开始显影,呈不均匀的高增强,5min后造影剂基本消退。腹腔注射GNP/PFP/PLGA-PEG-FA后即刻、20mmin、2h和4h分别采用LIFU作用和激光辐照,每次作用前基波与谐波下均无明显改变,腹腔注射完即刻用LIFU作用和激光辐照,作用区在基波下可见回声增强,谐波下增强更明显,未受到促发的区域回声无改变。20分钟后,两种方式再次促发后,基波与谐波下仍可观察到明显增强显像。2小时后,两种方式第三次促发后,基波与谐波下仍可观察到增强显像,但强度减弱。4小时后,第四次促发后,未观察到增强显像。腹腔注射PFP/PLGA-PEG-FA后,在各个时点以LIFU作用后观察到与GNP/PFP/PLGA-PEG-FA一致的增强显像,但各个时点以激光辐照前后均未观察到增强显像。结论 ①在体外,LIFU和激光均可致GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相变,增强超声显像； ②在离体组织中,LIFU和激光均也可致GNP/PFP/PLGA-PEG-FA相变,增强超声显像； ③在体内,GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的留存时间显著延长,通过LIFU和激光促发后,均可在作用区域发生观察到增强显像； ④GNP/PFP/PLGA-PEG-FA的显像与声诺维不同,只有在受到外界能量促发才能在相应区域显像。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R445.1

【参考文献】