耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究

发布时间：2017-05-10 11:23

  本文关键词：耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:耐辐射球菌是一种对电离辐射、紫外线等辐射引起的致死和突变效应具有极强抗性的微生物。这类超强的辐射抗性和它自身拥有的完善高效的DNA损伤修复通路密切相关。PprI是耐辐射球菌中一个独有的功能蛋白,它在DNA损伤修复的复杂调控中起着关键作用,被认为是耐辐射球菌DNA损伤修复通路的靶开关。耐辐射球菌发现50余年来,耐辐射球菌PprI蛋白对原核生物的辐射防治作用及其抗辐射机制已有较深入的研究。本课题则研究在真核系统中高效表达和纯化PprI和TAT-PprI蛋白的方法,并且探讨其在真核细胞中的抗辐射作用和机制,为急性放射损伤的临床防治提供有价值的实验资料,迄今尚未见国内外报道。材料与方法:本实验以本课题组吴伟硕士构建的pHBM905A-His-PprI载体和乔惠萍博士构建的pPICZαA-TAT-PprI载体为模板,在毕赤酵母表达系统中优化表达和纯化条件,旨在获得大量的耐辐射球菌PprI蛋白和TAT-PprI蛋白。以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为作用对象,应用免疫荧光实验观察PprI和TAT-PprI蛋白在细胞内的分布情况,应用CCK-8法检测PprI和TAT-PprI蛋白对HUVEC毒性和辐射细胞增殖的影响,应用克隆形成实验检测PprI和TAT-PprI蛋白对辐射细胞存活的影响。抗氧化实验应用荧光探针DCFH-DA检测PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVEC ROS水平的影响,同时应用抗氧化试剂盒检测PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVEC超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。细胞凋亡实验应用流式细胞仪检测PprI和TAT-PprI蛋白对HUVEC凋亡的影响,同时应用免疫印迹检测PprI和TAT-PprI蛋白对线粒体凋亡通路相关蛋白(Bcl-2、Bax)表达的影响。DNA损伤修复实验应用免疫荧光实验观察PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVECγH2AX焦点数的影响,同时应用免疫印迹检测PprI和TAT-PprI蛋白对真核生物重组修复蛋白(Rad51)表达的影响。结果:1.成功优化了耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白的表达及纯化条件,一次培养高效获得了5 mg耐辐射球菌PprI蛋白和5 mg TAT-PprI蛋白。2.与普通的耐辐射球菌ppri蛋白相比,tat-ppri蛋白具有较强的跨膜能力,进入细胞主要与细胞器和细胞核作用。3.细胞毒性实验结果显示,耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白分别在0-10、0-25μg/ml的浓度范围内对huvec无毒性作用(p0.05)。ppri蛋白浓度大于20μg/ml时对huvec的生长产生抑制作用(p0.05),ppri蛋白与huvec作用24、48、72h细胞的半抑制率ic50值分别为63.58、51.80、32.46μg/ml;tat-ppri蛋白浓度大于50μg/ml时对细胞的生长产生抑制作用(p0.05),tat-ppri蛋白与huvec作用24、48、72h细胞的半抑制率ic50值分别为107.90、97.26、87.55μg/ml。4.细胞增殖实验结果显示ppri和tat-ppri蛋白浓度在0.8-8μg/ml时对受照细胞的增殖有明显的促进作用(p0.05~0.001)。5.辐射细胞存活曲线显示,细胞吸收剂量为2、4、6、8gy时,ppri和tat-ppri蛋白作用组的辐射细胞存活分数均高于单纯照射组,结果具有显著性统计学差异(p0.05~0.001);ppri和tat-ppri蛋白作用组的存活曲线参数d0、dq、n、sf2值也高于单纯照射组;并且吸收剂量为4、6和8gy时,tat-ppri蛋白作用组的存活分数显著高于ppri蛋白作用组(p0.05)。6.抗氧化实验结果显示,与单纯照射组比较,huvec在照射前给予耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能显著降低细胞内的ros水平(p0.001)和mda含量(p0.05);照射前加入耐辐射球菌tat-ppri蛋白细胞内sod活性和cat活性均显著高于单纯照射组和ppri蛋白组(p0.05),而照前加入耐辐射球菌ppri蛋白对增加细胞内sod活性和cat活性无影响(p0.05)。7.细胞凋亡实验结果显示,与单纯照射组相比,照射前给予耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能显著降低受照细胞凋亡率(p0.01~0.001);并且照射前给予tat-ppri蛋白增加了bcl-2的表达,同时降低了bax的表达(p0.01~0.001),而照射前加入耐辐射球菌ppri蛋白与单纯照射组相比bcl-2和bax的表达量无显著差异(p0.05)。8.dna损伤修复实验结果显示,与单纯照射组相比,照射前给予耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白均能显著降低受照细胞γh2ax焦点数(p0.05),并且显著增加rad51蛋白的表达量(p0.01~0.001)。结论:1.成功优化了含耐辐射球菌pprI基因的毕赤酵母重组pHBM905A-His-PprI/GS115菌株和pPICZαA-TAT-PprI/X33菌株的表达及纯化条件,获得了大量的耐辐射球菌PprI融合蛋白和TAT-PprI融合蛋白。2.TAT蛋白转导域能介导PprI蛋白跨膜进入细胞,广泛分布于细胞质与细胞核。3.细胞毒性实验结果显示,耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白具有较宽的安全剂量范围,分别在0-10、0-25μg/mL的浓度范围内对细胞生长无抑制作用。4.细胞增殖实验结果表明,耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白安全剂量范围内具有一个较宽的细胞增殖浓度范围(0.8-8μg/mL),在该范围内PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVEC的增殖有明显的促进作用。5.耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白能增加细胞的平均致死剂量,提高细胞的放射抗拒性,增强细胞辐射损伤的修复能力。并且TAT-PprI蛋白的抗辐射效果更显著。6.耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白显著降低受照细胞内活性氧的水平,增强了抗氧化酶的活性,降低了细胞脂质过氧化的程度。与耐辐射球菌PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白的抗氧化作用更显著。7.耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白显著降低辐射细胞的凋亡率。与耐辐射球菌PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白在调控细胞凋亡线粒体通道蛋白的表达方面发挥更显著的作用。8.耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白显著降低受照细胞γH2AX焦点数,促进了DNA修复蛋白Rad51的表达。与PprI蛋白相比,TAT-PprI蛋白在DNA损伤修复方面发挥的作用更显著。总之,我们在国内外首次在毕赤酵母中获得高效表达和纯化的耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白,并将该原核蛋白成功用于人离体细胞急性放射损伤的防治,发现该蛋白具有显著地抗辐射损伤作用,该作用与其抗氧化、抗凋亡及增强DNA损伤修复的机制密切相关,具有跨膜作用的TAT-PprI蛋白的抗辐射作用显著优于PprI蛋白。
【关键词】：耐辐射球菌 PprI蛋白 毕赤酵母 辐射抗性 DNA损伤修复
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R811
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 前言14-19
• 一、耐辐射球菌Ppr I蛋白的发现14
• 二、耐辐射球菌Ppr I蛋白的结构14-15
• 三、耐辐射球菌Ppr I蛋白的功能研究15
• 四、耐辐射球菌Ppr I蛋白研究进展及本实验要解决的问题15-16
• 参考文献16-19
• 第一部分 耐辐射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白在毕赤酵母菌中的高效表达及纯化19-35
• 材料与方法19-25
• 一、材料19-23
• 二、实验方法23-25
• 结果25-31
• 一、耐辐射球菌Ppr I蛋白的表达纯化25-27
• 二、耐辐射球菌TAT-Ppr I蛋白的表达与纯化27-31
• 讨论31-33
• 小结33
• 参考文献33-35
• 第二部分 耐辐射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白在人脐静脉内皮细胞内分布、毒性及辐射生存作用的研究35-48
• 材料与方法35-38
• 一、材料35-36
• 二、实验方法36-38
• 结果38-44
• 一、免疫荧光实验观察Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白在HUVEC分布38-39
• 二、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白的细胞毒性作用39-42
• 三、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白的细胞增殖作用42-43
• 四、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白对辐射细胞克隆形成的影响43-44
• 讨论44-45
• 小结45-46
• 参考文献46-48
• 第三部分 耐辐射球菌Ppr I和TAT-Ppr I蛋白对人脐静脉内皮细胞辐射损伤修复机制的研究48-74
• 材料与方法48-55
• 一、材料48-51
• 二、实验方法51-55
• 结果55-68
• 一、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白对细胞内抗氧化酶类的影响55-59
• 二、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白对细胞凋亡的影响59-63
• 三、耐辐射球菌Ppr I蛋白、TAT-Ppr I蛋白对DNA损伤修复的影响63-68
• 讨论68-71
• 小结71
• 参考文献71-74
• 结论74-76
• 综述 耐辐射球菌辐射抗性和DNA修复机制的研究进展76-85
• 参考文献80-85
• 研究生期间发表论文85-86
• 附录86-88
• 致谢88-89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈婷婷;连利霞;牟英;杨占山;;抗辐射球菌pprI基因活体电转染救治小鼠γ射线损伤的实验研究[J];辐射研究与辐射工艺学报;2010年03期

2 丛瑛;吴伟;文玲;杨占山;;耐辐射球菌pprI基因转染对受照酵母菌抗氧化能力的影响[J];辐射研究与辐射工艺学报;2013年04期

  本文关键词：耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：354660