转化生长因子-β3调控循环纤维细胞在放射性肺纤维化中的作用研究
发布时间：2017-09-06 18:31
本文关键词：转化生长因子-β3调控循环纤维细胞在放射性肺纤维化中的作用研究
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【摘要】：目的意义:放射性肺纤维化是临床胸部肿瘤放疗常见的并发症之一,也可发生于骨髓移植手术前的放疗预处理及其它意外照射,其主要特征为肺脏内纤维结缔组织增多,实质细胞减少,持续进展可致肺脏结构破坏和功能减退,乃至肺功能衰竭,严重威胁人类健康和生命。临床上放射性肺纤维化缺乏特异、有效的治疗措施,患者预后较差。因此研究并阐明放射性肺纤维化发生的规律与特征和分子机制,对于临床上预测放射性肺纤维化的发生和转归,寻找干预、治疗的手段有着极其重要的意义。研究表明,转化生长因子β-1(transforming growth factor-β,TGF-β1)是重要的促纤维化因子之一,在肺纤维化过程中调控成纤维细胞分裂、增殖及细胞外基质的沉积,促进纤维化的发生。然而TGF-β3在组织损伤修复中表现出了不同于TGF-β1的抗纤维化特性,但是目前缺少TGF-β3用于放射性肺纤维化干预措施的依据。本研究以雌性C57BL/6小鼠为实验对象,建立放射性肺纤维化模型,观察TGF-β3对小鼠放射性肺纤维化的影响,寻找TGF-β3在放射性肺纤维化中可能的调控机制,为临床放射性肺纤维化的预防和治疗提供新的线索。材料与方法:雌性C57BL/6小鼠(6-8周,20±2g)麻醉后固定于自制的照射板上,除胸部外其余部分用10cm铅砖防护,采用60Coγ-射线单次胸部照射,照射剂量为20Gy,照射源距3m,剂量率215c Gy/min。在照后4h照射组给予腹腔注射0.5ml生理盐水,TGF-β3组给予0.5ml人重组TGF-β3(1μg/kgbw,生理盐水稀释),此后每周给药一次。分别于照后1个月、3个月和6个月,观察小鼠的大体情况,检测外周血细胞参数,活杀后进行常规病理检查和Masson三色染色观察,免疫组织化学法检测肺组织中基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9,MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)的表达,检测肺灌洗液(BALF)中细胞分类及细胞因子含量,流式细胞技术检测外周血Treg、肺内循环纤维细胞、Th17与Treg等。采用分离培养人外周血白膜的单个核细胞(PBMC)及Treg细胞建立体外培养体系,分别以不同剂量、不同比例的TGF-β1和TGF-β3混合刺激PBMC,通过流式细胞技术检测PBMC向循环纤维细胞的分化情况。并将Treg细胞与PBMC共培养,检测Treg细胞对PBMC向循环纤维细胞的分化的影响。实验结果：1、60~Coγ-射线单次胸部20Gy照射后小鼠体重增加变缓,肺重略微增加,因而肺脏系数也略微增加。2、小鼠照射后外周血白细胞数有一定波动,TGF-β3组血红细胞显著降低(P0.05),血小板有增高趋势。3、BALF中有核细胞计数和分类结果显示照射组与TGF-β3组BALF中细胞总数和中性粒细胞数有增高的趋势,但统计学无显著差异。液体悬浮芯片细胞因子检测结果显示照射后小鼠BALF中趋化因子有先增高后降低的趋势。而TGF-β3组促炎因子IL-12分泌增多、抑炎因子IL-4分泌减少。照射组的促炎因子IL-17随着照后时间延长有增加的趋势,其中在照后6个月显著高于对照组(P0.05),而TGF-β3组的IL-17变化情况跟照射组正好相反,在照后1个月时显著增加(P0.05),随后降低并恢复至正常水平。生长因子中,照射组和TGF-β3组的FGF-basic在照后出现了先增高再降低最后恢复的波动情况。照射组的VEGF在照后有增高的趋势,其中在照后1个月和照后6个月时与对照组相比显著增加(P0.05)。4、照射能够引起照射组小鼠出现肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、成纤维细胞大量增生、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积的典型纤维化病理改变。给予TGF-β3组小鼠病理变化比照射组出现的晚且程度较轻,同时胶原沉积减少,但仍然可见炎性淋巴细胞浸润,蛋白样液体渗出,局部肺泡萎陷,部分肺泡腔融合扩大,局部肺泡间隔增宽,以及部分绿染的胶原纤维。5、免疫组化结果显示照射后小鼠肺内MMP-9、TIMP-1表达与对照组相比均明显增加,其中MMP-9随照后时间的延长增加的更为显著,TGF-β3组MMP-9表达显著高于照射组(P0.05)。TIMP-1随照后时间延长变化趋势不明显。6、照射组小鼠从照后1个月起肺内循环纤维细胞明显增加(P0.05),随照后时间的延长,出现降低,但仍高于对照组(P0.05)。照后1个月时,TGF-β3组循环纤维细胞数明显低于照射组(P0.05),与对照组相比仍有增高(P0.05);3m时与照射组水平接近;而6个月时低于照射组,恢复至对照组水平。7、照射组和TGF-β3组外周血Treg细胞比例随着照后时间的延长有降低趋势,但与对照组相比无明显差异。照射组肺内Th17细胞比例均显著高于对照组(P0.05),而且随着照后时间延长而增高。而TGF-β3组变化规律和照射组相反,Th17细胞比例随着照后时间延长而降低,在照后1个月达到高峰,且显著高于照射组(P0.05),到了照后6个月时,虽然仍然显著高于对照组(P0.05),但已经显著低于照射组(P0.05)。照射组肺内Treg细胞比例均显著高于对照组(P0.05),而且随着照后时间延长而降低。而TGF-β3组Treg细胞比例随着照后时间延长而波动,其中在照后3个月达到高峰,且显著高于照射组(P0.05)。照射组Th17/Treg细胞比例随着照后时间延长而增高,其中在照后6个月时显著高于对照组(P0.05)。而TGF-β3组Th17/Treg细胞比例随着照后时间延长而降低,在照后1个月达到高峰,显著高于照射组与对照组(P0.05),到了照后6个月时,与对照组相比已经无明显差异并且显著低于照射组(P0.05)。8、体外实验结果表明,TGF-β1和TGF-β3都能促进体外培养的人PBMC向循环纤维细胞分化,但TGF-β3的促分化能力显著弱于TGF-β1。另外TGF-β3能够部分拮抗TGF-β1诱导PBMC向循环纤维细胞分化的能力。Treg在一定比例时与PBMC共培养可以促进PBMC向循环纤维细胞分化,但随着Treg与PBMC的比例上升,Treg反而表现出抑制PBMC向循环纤维细胞分化的能力,而且这种调控能力并不依赖于Treg和PBMC的接触抑制。结论：1、TGF-β3可以减轻小鼠放射性肺纤维化的程度,延缓放射性肺纤维化的病程。2、TGF-β3通过调节肺内MMP-9/TIMP-1比例、Th1/Th2型细胞因子、Th17/Treg细胞平衡、减少肺内循环纤维细胞的募集与分化减轻小鼠放射性肺纤维化。3、TGF-β3可以部分拮抗TGF-β1诱导的体外离体培养的循环纤维细胞的分化。4、Treg可以调控体外离体培养的循环纤维细胞的分化。TGF-β3可能通过调控Th17/Treg细胞比例调控调控体外离体培养的循环纤维细胞的分化。
【关键词】：放射性肺纤维化 转化生长因子β 循环纤维细胞 调节性T细胞 辅助性T细胞
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.55
【目录】：
- 缩略词表4-5
- 缩略词表续5-6
- 中文摘要6-9
- Abstract9-13
- 前言13-17
- 第一部分TGF-β3对小鼠放射性肺纤维化的影响17-44
- 1.1 引言17
- 1.2 材料与方法17-23
- 1.3 结果23-41
- 1.4 讨论41-44
- 第二部分TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的调控机制研究44-55
- 2.1 引言44
- 2.2 材料与方法44-48
- 2.3 结果48-52
- 2.4 讨论52-55
- 第三部分TGF-β3与Treg对离体培养的人循环纤维细胞分化的影响55-68
- 3.1 引言55-56
- 3.2 材料与方法56-60
- 3.3 结果60-66
- 3.4 讨论66-68
- 全文总结及创新点68-70
- 参考文献70-81
- 综述81-96
- 参考文献89-96
- 论著96-103
- 个人简历103-104
- 致谢10
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