卵母细胞分泌因子在人MⅡ卵母细胞的卵丘颗粒细胞中的表达及其与卵母细胞发育潜能关系的研究

发布时间：2017-10-21 12:25

  本文关键词：卵母细胞分泌因子在人MⅡ卵母细胞的卵丘颗粒细胞中的表达及其与卵母细胞发育潜能关系的研究

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【摘要】：目的:卵丘颗粒细胞(Cumulus Cells,CCs)为直接包绕在卵母细胞周围的颗粒细胞,分解代谢胆固醇和葡萄糖等物质,通过与卵母细胞周围的缝隙连接为卵母细胞提供能量,在卵母细胞发育成熟、排卵至受精的整个过程中起着关键性的作用。近年来的研究提示CCs中基因表达的差异可以作为预测卵子及胚胎发育潜能的一种有效的非侵入性方法。GDF-9、BMP-15、TGFβ1均为TGF-β超家族成员,Smads是TGFβ超家族下游信号传导分子,但是Smad3在CCs中的作用还不确定。GDF-9可以启动始基卵泡,促进卵泡生长,刺激CCs增殖,刺激卵丘膨胀,促进透明质酸酶合成,调控卵母细胞减数分裂能力,提高卵母细胞发育潜能。BMP-15具有促进CCs减数分裂与增殖的作用,并且其促进CCs减数分裂的作用是不依赖于FSH的。TGFβl通过对CCs上受体的作用而影响卵母细胞的发育和其后的受精分裂潜能,TGFβl对卵子的质量及早期胚胎发育起着关键作用。TGFβ/Smads能促进CCs的增殖与分化,和促性腺激素共同调控卵泡的生长。GDF-9可以刺激人卵巢CCs中Smads蛋白的磷酸化水平升高,与I型受体及II型结合后激活Smad3,能促进CCs增殖。本实验通过分析单卵母细胞所对应的CCs中GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3的表达水平,探讨上述细胞因子与卵母细胞质量与发育潜能的关系;观察常规长方案和微刺激方案2种超促排卵处理方法对细胞因子表达的影响,比较2种超排处理方法对卵母细胞质量及其发育潜能的差异。方法:1研究对象收集2013.10?2014.12期间在石家庄白求恩国际和平医院生殖中心接受ICSI助孕治疗的患者41例332份CCs,纳入标准:年龄35岁;双侧卵巢无手术史;基础激素水平正常(月经周期第2-3天,FSH10IU/L,E250pg/ml,PRL在正常范围);月经周期正常(26-32天);体重指数BMI18-25;无其他慢性疾病及内分泌疾病,近3个月内未应用过激素类药物。排除标准:高雄激素血症的表现;PCOS;子宫内膜异位症。不孕原因主要为男方因素或曾有过IVF不受精史。所有受试患者均经医院伦理委员会批准后,签署知情同意书。2控制性超促排卵用药方案(1)患者采用常规长方案促排卵:在黄体中期开始给予Gn RH-a皮下注射降调节,达到降调节标准后给以促卵泡成熟激素果纳芬进行促排卵,启动剂量一般给予150-300 IU/d皮下注射,根据患者卵泡发育情况及卵巢基础窦状卵泡数目及时调整药物剂量,当双侧卵巢中直径≥18mm/≥14mm的卵泡为60%-70%,测血清E2/14mm的卵泡为200?300 pg/ml时停药,给予重组人绒毛膜促性腺激素250μg(r HCG,Ovidre,Merck Serono Switzerland)皮下注射,36h后阴道超声引导下取卵。(2)患者采用微刺激方案促排卵:在月经第3天给予HMG(注射用尿促性素)常规剂量225IU/天注射,同时给予药物来曲唑2.5mg/天口服,5天后停用LE,给予CC(氯米芬)50mg/天口服,当双侧卵巢中直径≥18 mm/≥14mm的卵泡为60%-70%,测血清E2/14mm的卵泡为200?300 pg/ml时停药,给予达菲林0.1mg皮下注射,36 h后阴道超声引导下取卵。3 CCs的留取扳机36h后阴道超声引导下取卵,找到卵-冠-丘复合物(COC),将单COC放入MOPS制成的微滴中,用机械法小心剥离卵子周围的CCs,将微滴中的卵丘颗粒细胞装入小EP管中,用PH值为7.4的PBS液反复冲洗,冻存于-80℃冰箱实验备用。4 RNA的提取及逆转录(RT)反应RNA的提取方法按照Trizole法进行,加入20μL DEPC水充分溶解。然后将提取的RNA取1μl进行琼脂糖凝胶电泳,测定结果符合标准后,从各样品中提取8μL RNA样品加入到20μL逆转录的体系中,按照Reverse Transcription Reaction试剂盒的说明书的操作要求进行逆转录反应,反应条件如下:70℃10min,42℃50min,95℃5min。5实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)应用Primer Premier 5.0软件设计目的基因和内参基因(RPL-15)引物序列。各基因引物序列见表1。反应按照QIAGEN Rotor-Gene Q公司Quanti Fast#174;SYBR#174;Green PCR kit荧光定量PCR反应试剂盒说明书进行:具体条件设置如下:95℃预变性2 min;95℃变性15s,60℃退火/延伸30s,共40个循环。运算分析最终所得Ct值。6数据统计分析将real time RT-PCR所得的Ct值按照公式2ΔCt进行运算,数据以均数±标准差(x±s)表示,利用SPSS13.0软件进行统计学处理,比较组间细胞因子水平的差异采用独立样本t检验,P0.05时差异有统计学意义。结果:1 CCs根据促排卵方案不同分为两组:常规长方案组(CC=172份)及微刺激组(CC=160份)。因卵母细胞与卵丘颗粒细胞是一一对应的,所以根据每个卵子受精、卵裂及囊胚发育情况,回顾性将CCs进行分组。根据卵子受精情况将CCs分为正常受精组(长方案组CCs=127份,微刺激方案组CCs=136份)及异常受精组(长方案组CCs=45份,微刺激方案组CCs=24份);正常受精组根据第3日胚胎卵裂情况分为优质卵裂胚形成组(长方案组CCs=58份,微刺激方案组CCs=76份)及非优质卵裂胚形成组(长方案组CCs=69份,微刺激方案组CCs=60份);非优质卵裂胚继续培养,根据第5日形成囊胚情况,分为优质囊胚形成组(长方案组CCs=24份,微刺激方案组CCs=12份)及非优质囊胚形成组(长方案组CCs=45份,微刺激方案组CCs=48份)。未成熟、畸形卵子所对应的卵丘颗粒不列入分组研究中。共有41例患者332份(常规长方案患者21例172份,微刺激方案20例160份)卵丘颗粒细胞用于RT-PCR检测。2人卵丘颗粒细胞中GDF-9与卵母细胞发育潜能的关系GDF-9有利于卵母细胞受精、卵裂及囊胚的形成。通过本实验可以看出,2种促排卵方案中,GDF-9 m RNA相对表达量:正常受精组显著高于异常受精组(P=0.020,P=0.001);优质卵裂胚形成组显著高于非优质卵裂胚形成组(P=0.001,P=0.043);优质囊胚形成组与非优质囊胚形成组间有统计学差异(P=0.002,P=0.001)。3人卵丘颗粒细胞中BMP-15与卵母细胞发育潜能的关系通过本实验可以看出,不论常规长方案组还是微刺激方案组,BMP-15 m RNA的相对表达量在卵母细胞发育的不同结局中均有显著性差异。2种促排方案中,BMP-15m RNA相对表达量:正常受精组显著高于异常受精组(P=0.000,P=0.000);优质卵裂胚形成组与非优质卵裂胚形成组,组间有显著性差异(P=0.003,P=0.048);优质囊胚形成组与非优质囊胚形成组间有明显统计学差异(P=0.033,P=0.029)。可以看出,BMP-15m RNA相对含量与卵母细胞发育潜能成正相关。4人卵丘颗粒细胞中TGF-β1与卵母细胞发育潜能的关系TGFβl含量与卵子的质量和发育潜能密切相关。TGF-β1基因m RNA无论在常规长方案组还是微刺激方案组中,其相对表达量在正常受精组中显著高于异常受精组(P=0.003,P=0.022);优质卵裂胚形成组显著高于非优质卵裂胚形成组(P=0.015,P=0.022);优质囊胚形成组与非优质囊胚形成组间有明显统计学差异(P=0.001,P=0.025)。5人卵丘颗粒细胞中Smad3与卵母细胞发育潜能的关系常规长方案组及微刺激方案组中,Smad3 m RNA的相对表达量正常受精组显著高于异常受精组(P=0.006,P=0.012);优质卵裂胚形成组与非优质卵裂胚形成组,组间比较有显著性差异(P=0.019,P=0.041);优质囊胚形成组与非优质囊胚形成组间有明显统计学差异(P=0.000,P=0.028)。可以看出,卵丘颗粒细胞中Smad3 m RNA的含量较高的卵母细胞有较好的发育潜能。6不同促排方案与GDF-9、BMP-15、TGF-β1和Smad3表达量的关系常规长方案与微刺激方案中,年龄无统计学差异。GDF-9和Smad3相对表达量在常规长方案组中显著高于微刺激方案组(P=0.000,P=0.004,P=0.005),BMP-15相对表达量在微刺激组中显著高于常规长方案组(P=0.004),而TGF-β1相对表达量在常规长方案组中和微刺激方案组中无统计学差异(P=0.653)。提示GDF-9、BMP-15和Smad3因子在CCs中的表达量与促排卵方案有关,常规长方案组可以刺激CCs分泌更多的GDF-9和Smad3因子,微刺激方案组可以刺激CCs分泌更多的BMP-15因子,TGF-β1相对含量与促排卵方案无关。结论:1 GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3在卵丘颗粒细胞中的相对表达量与卵母细胞质量及发育潜能成正相关,提示其可以作为评价卵母细胞质量、预测卵母细胞的发育潜能的客观指标。2不同的促排卵方案可能影响卵丘颗粒细胞中的卵母细胞因子表达谱,且与MⅡ期卵母细胞发育潜能有关。
【关键词】：卵母细胞分泌因子 人卵丘颗粒细胞 卵胞浆内单精子显微注射 胚胎发育潜能 卵母细胞质量 常规长方案 微刺激方案
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.8
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-16
• 英文缩写16-17
• 前言17-18
• 材料与方法18-28
• 结果28-33
• 附图33-37
• 附表37-42
• 讨论42-46
• 结论46-47
• 参考文献47-53
• 综述53-64
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

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本文编号：1073356