新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制

发布时间：2017-10-30 15:08

  本文关键词：新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制

  更多相关文章： 围产期缺氧缺血性脑病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy HIE) 缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage HIBD) Tim-3(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3) 小胶质细胞

【摘要】：围产期缺氧缺血性脑病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是导致儿童残疾的最重要的疾病。因此缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的机制研究已成为当今医学研究的重要课题之一。其发病机制主要包括有兴奋性氨基酸中毒、氧自由基、钙超载、免疫炎症反应等。虽然有关缺血性脑细胞死亡的兴奋性毒性和氧化胁迫以及细胞凋亡方面的研究已经取得一定进展,但HIE的临床治疗效果仍不理想。近年来脑缺氧缺血再灌注导致的炎症免疫损伤机制日益受到人们的关注。由缺氧缺血再灌注诱导的过度炎症反应是导致脑组织损伤的主要原因之一。Tim-3 (T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)是一种新型免疫调节因子,已被发现表达于多种免疫细胞上,在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要得调节作用。表达于Th1细胞表面的Tim-3与其配体galectin-9一起,可抑制免疫反应,诱导Th1细胞凋亡。Tim-3与巨噬细胞M1/M2的极化、移植免疫耐受、肿瘤免疫反应等多种免疫调节过程相关。Tim-3在免疫炎症相关疾病中已显示出潜在的治疗作用,但有关其在HIBD中作用及机制的研究尚属首次。本研究利用动物模型和体外细胞模型,通过正反双向论证,对Tim-3在围产期HIBD中的作用进行系统的研究。研究发现：1、缺氧缺血刺激促进脑内Tim-3表达显著升高,并主要集中于活化的小胶质细胞。给予新生小鼠缺氧缺血刺激,通过病理组织学分析、凋亡检测等方法判断神经元损伤程度；利用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色及激光共聚焦技术检测脑内Tim-3的表达及细胞定位。结果显示,HIBD组小鼠脑内缺血敏感区Tim-3表达显著上调,活化小胶质细胞是脑内Tim-3的主要来源。2、Tim-3对小胶质细胞功能的调控机制研究。本研究分别利用Tim-3过表达质粒及小干扰RNA在BV2细胞系上构建Tim-3过表达、敲减、阻断模型,研究Tim-3对缺氧缺血再复灌介导的小胶质细胞分泌炎性细胞因子及NO功能的影响。研究发现,Tim-3可通过NF-κ B途径,增强小胶质细胞中TNF-α,IL-1β等促炎因子及iNOS的表达,介导缺氧缺血再灌注后脑内的炎症反应。3、特异性阻断Tim-3的作用可对HIBD损伤神经元产生保护作用。我们利用Tim-3阻断性抗体及Tim-3mut小鼠特异性阻断Tim-3的作用,通过病理组织学分析、凋亡检测等方法判断神经元损伤程度；利用水迷宫及旷场实验,检测小鼠运动及空间学习记忆能力。研究发现,特异性阻断Tim-3的作用可显著减轻缺氧缺血刺激后小鼠脑内的炎症反应,对神经元产生保护作用。本研究的实施与完成,首次揭示新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制,为新生儿缺氧缺血性脑病的病理机制研究及临床治疗策略提供了新的思路,具有重要的理论研究及临床应用价值。研究目的：本研究利用HIBD动物模型和体外细胞模型,以缺氧缺血再灌注过程中,激活的脑内小胶质细胞为研究对象,探讨该病理过程中Tim-3的表达,及其对小胶质细胞功能的调节,深入探讨Tim-3在缺氧缺血诱导的脑内炎症反应及缺血缺氧敏感神经元死亡中发挥的作用及其分子机制。研究方法：1、Tim-3表达与HIBD损伤程度相关性研究：1) HIBD动物模型构建方法：新生7天C57小鼠结扎右侧颈总动脉,8%氧气环境下缺氧1.5小时,3大后灌流取脑。2) Western Blot、RT-PCR、免疫荧光方法检测HIBD动物模型中Tim-3表达。3) RT-PCR方法检测HIBD动物模型中TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。4) HE、TUNEL方法检测脑损伤程度。2、Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究：2. 1、OGD/R刺激BV2细胞后Tim-3的表达及细胞因子的分泌：1) OGD/R模型构建：给予BV2细胞不含葡萄糖和血清的1640培养基,1%氧气环境下培养3h,更换正常培养基,在正常培养条件下复氧36h。2) Western Blot、RT-PCR、免疫荧光方法检测Tim-3表达。3) RT-PCR方法检测TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。2.2、Tim-3对BV2分泌细胞因子的影响：1)构建BV2细胞Tim-3过表达、敲减及抗体阻断模型,给予OGD/R刺激。2) RT-PCR方法检测TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。3) ELISA检测细胞上清中TNF-α等细胞因子及NO含量。2.3、Tim-3下游部分信号通路：构建BV2细胞Tim-3过表达、敲减模型,给予OGD/R刺激,Western Blot检测Tim-3下游信号通路相关蛋白的表达。3、阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用：1) HIBD模型构建成功后,给予Tim-3阻断抗体5mg/kg腹腔注射,连续3天,对照组给予同型IgG抗体。同时应用Tim-3mut小鼠构建动物模型。3天后灌流取脑。2) TUNEL方法检测小鼠脑损伤程度。3) RT-PCR方法检测小鼠脑内TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。4) Tim-3mut组小鼠及其对照组野生型小鼠构建HIBD模型,饲养到4周,进行水迷宫及旷场实验,检测小鼠运动及空间学习记忆能力。研究结果：1、Tim-3表达与HIBD损伤程度相关性研究：1)HIBD动物缺血侧脑内大脑皮层、海马及纹状体等缺血敏感区Tim-3表达升高,炎性细胞因子及iNOS的mRNA表达量也均升高。2)Tim-3阳性细胞与CDllb阳性细胞几乎完全重合,提示HIBD动物模型中,Tim-3主要来源于活化的小胶质细胞。2、Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究：1)在BV2细胞Tim-3过表达、敲减及抗体阻断模型中,TNF-α等炎性细胞因子及NO的分泌量随Tim-3表达量改变而改变。2) NF-κB磷酸化程度随Tim-3表达量改变而改变。3、阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用：1)给予Tim-3阻断抗体或应用Tim-3敲基因鼠构建HIBD模型后,小鼠脑内缺血敏感区TUNEL阳性细胞明显减少。2)给予Tim-3阻断抗体或应用Tim-3敲基因鼠构建HIBD模型后,小鼠脑组织中TNF-α等炎性细胞因子及iNOS的mRNA表达量降低。3) Tim-3mu组小鼠学习记忆能力较野生型小鼠显著提高。结论：1、在围产期缺氧缺血性脑损伤中,缺血敏感区如大脑皮层、海马及纹状体区Tim-3的表达增加,可能是导致选择性神经元凋亡的重要原因之一。2、活化的小胶质细胞是脑内Tim-3的主要来源。Tim-3可通过NF-κB途径,增强小胶质细胞中TNF-α, IL-1β等促炎因子及iNOS的表达,介导缺氧缺血再灌注后脑内的炎症反应。3、特异性阻断Tim-3的作用后,对围产期缺血缺氧再灌注损伤神经元可产生保护作用。
【关键词】：围产期缺氧缺血性脑病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy HIE) 缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage HIBD) Tim-3(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3) 小胶质细胞
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.7
【目录】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符号说明17-18
• 前言18-26
• 一、围产期缺氧缺血性脑病18-20
• 二、HIE中小胶质细胞的作用20-21
• 三、新型免疫调节分子Tim-3及其作用21-26
• 第一部分 Tim-3在HIBD动物模型中的表达及定位26-41
• 1、技术路线26
• 2、材料26-28
• 3、方法28-32
• 4、结果32-37
• 5、讨论37-39
• 6、结论39-41
• 第二部分 Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究41-55
• 1、技术路线41
• 2、方法41-46
• 3、结果46-52
• 4、讨论52-54
• 5、结论54-55
• 第三部分 阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用55-65
• 1、技术路线55
• 2、方法55-57
• 3、结果57-62
• 4、讨论62-64
• 5、结论64-65
• 参考文献65-70
• 硕士期间发表论文70
• 致谢70-71
• 学位论文评阅及答辩情况表71

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 朱圣韬;曹邦伟;徐昌青;李琴;赵志海;李丹萍;张澍田;;TIM-3基因启动子区多态性与胃癌易感的相关性研究[J];首都医科大学学报;2010年03期

2 程贵;蒋敬庭;吴昌平;;Tim-3在胃癌组织中的表达及其临床意义[J];临床肿瘤学杂志;2012年03期

3 朱汉钢,冯作化,耿辉,张桂梅;肿瘤组织中Tim-3表达的特征及其在肿瘤免疫耐受中的作用[J];细胞与分子免疫学杂志;2005年04期

4 高鑫;李刚;陈慧;汪家敏;张光波;卢斌峰;张学光;;人Tim-3基因克隆及其转基因细胞的构建[J];苏州大学学报(医学版);2011年02期

5 马德强;郝友华;杨东亮;;TIM-3分子与临床疾病相关研究进展[J];免疫学杂志;2010年11期

6 谢敏;李燕;陈庄;;TIM-3及其在哮喘中的研究进展[J];西南军医;2013年03期

7 赵国栋;朴勇瑞;;TIM-3在前列腺癌中的表达及其意义[J];实用医学杂志;2014年08期

8 唐海洋;谭利明;;阿托伐他汀对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑组织TIM-3、TIM-1表达的影响[J];中国医学创新;2012年36期

9 张志英;栾斌;冯晓霞;;Galectin-9及其受体Tim-3在哮喘小鼠肺组织中的表达[J];中国当代儿科杂志;2011年05期

10 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 黄波;;Tim-3，，从免疫调节分子到肿瘤相关的分子[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 曹阳;淋巴瘤血管内皮细胞异常表达Tim-3:一种新的肿瘤免疫逃避机制的探索研究[D];华中科技大学;2009年

2 侯楠;Tim-3调控单核/巨噬细胞和NK细胞参与动脉粥样硬化的研究[D];山东大学;2010年

3 杨家殟;Galectin-9和Tim-3在胃癌中的表达及作用机制的研究[D];吉林大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 石新慧;可溶性Tim-3在疾病中的表达及其意义的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

2 马霄耘;新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制[D];山东大学;2016年

3 由俊宇;Tim-3在急性高血压脑出血后炎症反应中的作用研究[D];山东大学;2011年

4 郭敏;新型磷酯酰丝氨酸受体Tim-3介导凋亡细胞吞噬关键结构域的研究[D];山东大学;2013年

5 刘晓;Tim-3调节巨噬细胞极化及其对肝癌细胞的生长的影响[D];山东大学;2012年

6 程贵;Tim-3在胃癌组织中的表达及其临床意义[D];苏州大学;2012年

7 朱金莲;Tim-3分子在胃癌髓源性抑制性细胞上的表达及其生物学功能[D];苏州大学;2014年

8 于佳卉;Tim-3融合蛋白的免疫干预作用及机制研究[D];河南大学;2015年

9 顾海迪;Tim-3分子在胃癌荷瘤个体NK细胞上的表达分析及临床意义[D];苏州大学;2013年

10 张志英;Galectin-9及其受体Tim-3在哮喘小鼠肺组织中的表达及作用[D];郑州大学;2011年

本文编号：1118125