内分泌紊乱和女性不孕：Phoenixin-14和雌激素水平的病理生理学研究

发布时间：2018-01-21 17:34

本文关键词： Phoenixin 多囊卵巢综合征黄体生成素体外受精-胚胎移植雌二醇子宫内膜胚胎种植蛋白组学　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：生殖过程中机体在内外部环境作用下,外周器官和中枢神经系统共同协作确保生物个体的成功繁殖。这个过程是通过协调生殖行为和排卵过程的下丘脑-垂体-卵巢轴完成。来自中枢神经系统的主要信号是促性腺激素释放激素(GnRH),GnRH通过调节垂体前叶促性腺激素的活性来调节卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的释放。随着卵巢内卵泡的发育,卵巢释放雌二醇,负反馈调节促性腺激素释放激素和卵泡刺激素的释放。当雌二醇水平达到峰值,可引发促性腺激素释放激素的快速释放,诱发黄体生成素峰最终完成排卵过程。中枢神经系统促性腺激素释放激素的释放有利于调节生殖行为从而为生殖调节提供一个节点。内分泌信号在控制生殖中起重要作用。个体逐渐生长足以说明中枢内分泌信号可以调节靶器官的生物过程,这种信号传导包括基因表达,细胞因子和/或淋巴因子的释放和激素的活性。此外,内分泌活动在胎儿的半同种异体种植过程起非常重要的作用。这种胎儿着床过程需要母亲免疫细胞重编程过程使得母亲在整个妊娠过程保持免疫耐受性。通常来说,母亲免疫细胞是支持所有的这些过程,并且有利于成功生育。不同内分泌介导的生理和病理生理过程中从不同方面影响女性受孕过程并诱发不孕。体外受精(IVF)技术的发明是20世纪医学界的一大奇迹,为数以万计家庭提供了获得子代的机会。然而,目前提高临床妊娠率仍然是生殖医学研究的大方向。为了改善不孕症的结局,我们实施了以下两个实验并得出了相应的结论。1.背景:多囊卵巢综合征(PCOS)是一种最常见的多因素作用下的内分泌紊乱性疾病,表现为复杂的内分泌病理过程包括黄体生成素(LH)水平的增加,胰岛素抵抗(IR)和高胰岛素血症。PCOS妇女常常表现为超重或者肥胖,2型糖尿病的风险增加和糖耐量受损以及心血管疾病。另外,7%生育期非PCOS妇女也常伴有高雄激素血症和慢性无排卵。然而,许多调节蛋白对PCOS发病机制的影响仍不清楚。黄体激素(LH)控制女性月经周期的长度和过程。重要的是,LH刺激和生成睾酮,睾酮又可以通过颗粒细胞转化成雌激素。越来越多的证据表明PCOS同时是一种代谢紊乱性疾病,一些不利的因素直接与高LH的分泌有关。有研究者认为无排卵和PCOS患者雄激素水平升高的机制是在高LH的刺激下,卵巢的卵泡膜细胞数增加,从而使得卵泡膜细胞产生的雄激素增加。由于LH相对于FSH水平升高,卵巢颗粒细胞不能将雄激素芳香化转变成雌激素,因此导致雌激素水平的下降和最终的无排卵。Phoenixin-14和Phoenixin-20是最近被分离和鉴定的两个新的内源性神经肽。Phoenixin-14是一种14个残基肽,在多种生物体内发现存在该物质,包括人脑,大鼠,小鼠,猪和犬。而phoenixin-20则是一种20残基肽,是Phoenixin-14N端扩展而成,在人,犬或猪序列的编码区之间的仅存在一个氨基酸的差异。在体外,用小RNA干扰方式敲除下丘脑phoenixin的表达,可导致雌性大鼠的发情期延迟,同时伴随着垂体GnRH受体的表达下降,提示phoenixin可能参与正常卵巢的周期调节。利用垂体前叶细胞的体外研究表明,phoenixin可通过调节垂体中促性腺激素释放激素(GnRH)受体的表达,上调垂体促性腺激素(包括FSH和LH)的分泌,并通过GnRH增强该受体本身的上调。基于以上研究基础,认为在大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中,phoenixin-14参与促性腺激素的分泌,本研究旨在研究PCOS患者中phoenixin-14的循环水平及其与LH分泌的关系。方法学:纳入自于浙江大学附属妇产科医院门诊病人78例妇女作为研究对象(其中37例为对照组,41例为PCOS患者),年龄24-35岁。所有患者都签署知情同意。PCOS的诊断标准依据欧洲生殖年会和美国生殖年会的联合标准,要求患者至少符合以下三项中的两项:1)稀发排卵或无排卵;2)临床和/或生化高雄激素血症(≥2.08 nmol/L);3)B超提示卵巢多囊改变(卵巢中直径2-9mm的小卵泡≥ 12个,或卵巢体积≥ 10 cm3)。排除甲状腺疾病,柯兴氏综合征,先天21-羟化酶缺乏,分泌雄激素的肿瘤,卵巢储备功能下降(原发卵巢功能不全),或者1型或2型糖尿病的患者。所有纳入患者都有临床和/或生化的高雄激素血症和慢性无排卵,绝大部分患者B超表现为多囊改变。对照组妇女月经周期规则(26-30天),无上述内分泌紊乱性疾病,最近三个月内无用药史。两组中其他的一些排除标准包括吸烟和酗酒的患者。空腹12小时后,在对照组和PCOS自然月经周期的3-5天早上9时采集血液样本。检测所有纳入的妇女中血液基础血清卵泡刺激素(FSH),黄体生成素(LH),孕酮(P4),泌乳素(PRL)和总睾酮(TT),游离睾酮(FTT),空腹血糖(FBG),空腹胰岛素(FSI),雄烯二酮(AS)和脱氢表雄酮(DHEA-S)水平。同时检测血清中总胆固醇(TCHOL),高密度脂蛋白(HDL)胆固醇,低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯(TG)的水平。激素的测定采用2006自动免疫分析仪,脂质的测定则采用Olympus临床化学分析仪(AU2700)。HOMA胰岛素抵抗指数按照标准公式计算。血液中Phoenixin-14,nesfatin-1和kisspeptin的浓度采用商业化的ELISA试剂盒进行测定。采用SPSS15.0进行数据的统计分析。对照组和PCOS组之间的各项参数比较采用t检验,用Pearson方法分析参数之间的相关性。结果:两组之间一般资料如年龄、BMI和生化指标如HDL,LDL,TG和TCHOL水平均无显著差异。然而,PCOS组性激素结合球蛋白,AS,DHEA-S,TT,游离TT,LH,PRL,FSI以及HOMA-IR指数均显著升高,但是两组之间的P4,FSH和E2水平无差异。PCOS患者血液中phoenixin-14水平显著较对照组升高(0.57±0.04 ng/mL vs.0.37±0.05ng/mL,n=37)。同样,血清中nesfatin-1水平在PCOS组患者中升高明显(p0.05)。但两组之间血清kisspeptin水平无显著差异。用phoenixin-14作为独立变量,多元相关分析结果显示在PCOS患者中,phoenixin-14与nesfatin-1和LH水平呈显著正相关,与HOMA-IR,kisspeptin,E2,FBG和胰岛素水平呈负相关,但未达统计学差异。结论:我们的结果指出,PCOS患者相对于正常妇女,血清中phoenixin-14显著升高。phoenixin-14与nesfatin-1和LH水平呈显著正相关,因此推测phoenixin-14的存在可能在一定程度上影响PCOS患者LH的分泌。然而,仍需要更多的研究来明确phoenixin-14 和 PCOS 的关系,从而有利于对 PCOS 不良生殖结局进行干预性的治疗。2.背景:正常子宫内膜是一类对卵巢类固醇类激素起反应的活性组织,随着月经周期经历增殖、分化和脱落的过程。雌激素和孕激素在人子宫内膜成熟中发挥重要的作用。在增殖期,雌二醇(E2)刺激内膜上皮细胞和间质细胞成分增殖。控制性超促排卵是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术中常用的手段,常伴随着雌二醇水平的显著升高。在IVF-ET治疗过程中同时有多个卵泡成熟产生超生理的E2水平,引发与子宫内膜容受性相关的形态学和生物化学改变。然而,升高的E2水平对子宫内膜种植的影响仍然存在争议。之前的研究报道血清E2水平在超促排卵过程中浓度依赖性的影响胚胎种植。临床研究同样获得了一些类似的结果。在过度刺激患者中,不考虑血清中孕酮的水平,注射hCG日高E2水平不影响胚胎质量,但对子宫内膜的容受性不利。另外一个研究发现升高的E2水平对胚胎有毒害作用,降低胚胎粘附。鉴于血清中高水平的E2可能浓度依赖性的影响IVF妊娠结局,我们评估了生理水平的E2对子宫内膜细胞的影响,来揭示在控制性超促排卵中升高的血清E2水平对子宫内膜细胞蛋白表达的可能影响。方法学:从上海生物科学研究所获得人类子宫内膜细胞-IK细胞,置于RPMI1640培养基中培养。用不同浓度的E2(10-9M和10-7M)进行细胞处理,10-9ME2接近妇女月经周期中分泌中期的生理浓度,10-7ME2接近超促排卵中超生理水平。体外粘附实验模型采用人类绒毛膜癌细胞系JAR细胞,参照标准的操作步骤制备细胞,加入到IK细胞中培养一个小时,离心六孔板(10×g;10分钟)使细胞表面朝下而分离非粘附球体。每组雌激素处理后的IK细胞用细胞裂解液裂解后收集细胞分离蛋白。送检不同浓度雌激素处理后的IK细胞,用iTRAQ方法进行蛋白组学测定,进行液相色谱-质谱(LC-MS/MS)的四种生物重复序列的蛋白质鉴定和定量,并结合Andromeda搜索引擎使用MaxQuant(MQ)软件进行分析。根据应用错误发现率(FDR)与过滤出B值的比值进行选择,即按照差异倍数≤0.67和≥1.5,或者P值≤0.05的标准过滤来选取差异蛋白。为了证实蛋白质组学结果,在两组中通过蛋白质印迹分析验证了三种已知在胚胎粘附中起作用的上调蛋白,包括补体(C3),纤溶酶原和激肽原-1。同时获得5个正常排卵周期(连续观察2个月经周期)LH峰后7天的子宫内膜组织做免疫组化进行验证。在子宫内膜活检前患者均签署知情同意书,实施的项目通过浙江大学医学院伦理委员会审批。结果保留了所有差异蛋白(pvalue0.05以及差异倍数超过1.2倍)。然后通过分层聚类分析(聚类分析 3.0,http://bonsai.hgc.jp/～mdehoon/software/cluster/software.htm 和 Java 树视图软件http://jtreeview.sourceforge.net)评估得到的差异表达蛋白进行区组。使用IPA功能分析法分析差异蛋白之间的生物调控网络,疾病分析和调控通路。计算z-score可以推断有潜在生物过程的激活状态("激活"或"抑制")。使用作图软件Prism6进行数据的统计分析。Fisher精确检验用于计算p值,以确定数据集中蛋白质之间的关联以及生物过程可以单独解释的可能性。使用非配对t检验,确定两组间比较的统计学意义。所有样品都进行四个生物重复的检测,数据以均数士标准差的形式表示,p0.05认为有统计学差异。结果:不同浓度的雌激素水平处理子宫内膜影响胚胎着床。10-9M浓度的雌激素作用后JAr粘附率为65.19±2.67%。然而,10-7M处理后的IK细胞的粘附率明显升高,为77.78±3.39%。使用iTRAQ技术,分析获得2,709差异表达蛋白,其中包括2,362上调蛋白和347下调蛋白。与对照组(10-9 M E2)相比,我们验证了 10-7 M雌激素处理后的45个差异蛋白,包括43个上调蛋白和2个下调蛋白。这些差异蛋白的聚类分析显示在热图中。热图结果显示两组明显分离成两个主要成份,提示10-7M雌激素处理组蛋白表达显著不同于10-9M雌激素处理组。使用Western blot验证补体C3,纤溶酶原和激肽原-1的表达与蛋白组学结果一致。结果提示高浓度雌激素处理后的IK细胞中补体C3,纤溶酶原和激肽原-1表达显著升高,推测10-7M雌激素处理后可能增加补体C3,纤溶酶原和激肽原-1表达促进JAr粘附到内膜细胞。在子宫内膜容受阶段,C3,纤溶酶原和激肽原-1在人子宫内膜中的定位表达揭示了这些蛋白质很可能是人子宫内膜容受性因子。此外,IPA分析结果显示10-7 M雌激素处理后绝大多数的差异表达蛋白都与"分子与细胞功能","生理系统功能"和"疾病与病症"有关。基于上述的p值,筛选出的差异表达蛋白其中有26个差异蛋白与子类别"生理系统与功能"和"疾病与紊乱"相关,而24个差异蛋白与子类别"分子和细胞功能"相关。为了理解在功能分组中显示出显著变化的蛋白质之间的特异性相互作用,我们利用IPA分析差异表达蛋白之间的相互作用网络。此外,雌激素处理后的内膜细胞呈现出两种典型的信号通路,包括LXR/RXR活化途径和通过最大数量的识别的差异表达蛋白介导的急性期反应信号以及表示由随机机会发现的对数概率的z-score。子宫内膜细胞系中的差异表达蛋白主要与调节途径相关,表明它们可能在粘附中具有关键作用。此外,上游调节分析可以预测上游分子,包括转录因子,微小RNA,激酶,化合物或药物,这些可能引起蛋白质表达模式的改变。用雌激素培养的子宫内膜细胞显示与子宫内膜容受性相关的上游调节物(TNF,IL6,Hmgn3和miR-140-3p),并且基于上述的差异表达蛋白的激活z-score来预测其为受激活或抑制状态。结论:综上所述,系统分析提供了理解子宫内膜雌激素依赖性蛋白变化的基础,子宫内膜的蛋白质分布与一些差异蛋白质与子宫容受性有关,并表明足够的剂量的雌激素可能作用子宫内膜胚胎界面的子宫内膜维持高反应性,提高患者胚胎着床率。此外,为了获得足够的证据和验证最低的卵巢刺激对胚胎移植的影响,我们仍需要进一步的分子和临床研究来阐明子宫内膜中剂量依赖性的雌激素对子宫内膜容受性影响的潜在机制,特别是控制性超促排卵患者卵泡期特别升高的雌二醇水平对子宫内膜的影响。这些发现将对于未来研究可能影响胚胎种植的蛋白质的功能也起着非常重要的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.6

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