NEDD4L在卵巢上皮癌的表达及作用研究

发布时间：2018-01-24 04:27

  本文关键词： 卵巢癌 Nedd4L 增殖 抑制 生物行为　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:研究Nedd4L在卵巢上皮癌的表达及对卵巢癌细胞生长、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响及相关的作用机制,探寻治疗卵巢癌的靶基因。方法:1.应用免疫组化技术检测Nedd4L在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织以及卵巢癌组织这种中的表达;2.采用卡方检验分析Nedd4L表达与卵巢癌患者临床病理学特点的关系;3.采用Ka Plan-Meier分析Nedd4L表达与患者疾病特异性生存时间的关系;4.采用脂质体转染法将含有Nedd4L的真核表达载体pc DNA3.1(+)-Nedd4L导入人卵巢癌细胞系SKVO3中,运用实时定量PCR方法、免疫组织化学染色及免疫细胞化学染色验证Nedd4L在卵巢癌细胞中的表达情况;5.含有Nedd4L的真核表达载体pc DNA3.1(+)-Nedd4L导入人卵巢癌细胞系SKVO3中,划痕实验、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞存活率;6.含有Nedd4L的真核表达载体pc DNA3.1(+)-Nedd4L导入人卵巢癌细胞系SKVO3中,利用流式细胞术检测Nedd4L重组表达载体转染后,Nedd4L对卵巢癌细胞的细胞周期及凋亡的影响;7.体内观察Nedd4L转染后裸鼠移植瘤的生长。结果:1.NEDD4L均在细胞浆内表达,染色深度为淡黄至棕黄色。在10例正常卵巢组织8例阳性,在10例卵巢良性肿瘤中9例阳性,25例卵巢交界性肿瘤20例阳性,72例卵巢癌32例阳性,NEDD4L在卵巢癌组的表达率明显低于于正常组、良性肿瘤组,差异具有显著性(p0.01)。2.在41例早期卵巢癌组织中,NEDD4L阳性表达数分别为25例(60.9%);31例晚期卵巢癌组织中,NEDD4L阳性表达数分别为7例(22.5%)。随着临床分期的增高,NEDD4L阳性表达率降低,NEDD4L的表达与临床分期差异具有显著性(P0.01)。在18例中低级别浆液性卵巢癌中,NEDD4L蛋白阳性表达数为11例(61%);23例高级别浆液性卵巢癌中,NEDD4L蛋白阳性表达数为7例(30.4%),提示分化越差,NEDD4L的阳性表达率越低,该差别具有统计学意义(P0.05)。在31例粘液性卵巢癌,中低分化19例,NEDD4L蛋白阳性表达数为6例(31.5%);12例高分化中,NEDD4L蛋白阳性表达数为8例(66.6%),在31例粘液性癌中NEDD4L阳性表达数为14例(45.1%);41例浆液性癌阳性表达数为18例(43.9%),NEDD4L的表达与组织分型差异无显著性(P0.05)。在31例已发生淋巴结转移的卵巢癌组织中,NEDD4L的阳性表达数为7例(22.5%);41例未发生淋巴结转移的卵巢癌组织中,NEDD4L阳性表达数为25例(60.9%)。NEDD4L的阳性表达率随着淋巴结转移的出现而明显降低,两组间表达差异具有统计学意义(P0.05)。3.利用Kaplan-Meier生存曲线分析:Nedd4L的表达水平与患者疾病特异性生存率密切相关,Nedd4L高表达组患者的生存时间明显长于低表达组。Nedd4L阳性表达的肿瘤患者5年生存率为59.27%,而阴性表达的患者5年生存率为21.32%。因此,Nedd4L的阳性和阴性表达在5年存活率上存在显著差异(P=0.02)。4.将含NEDD4L的重组表达载体pc DNA3.1(+)-Nedd4L转染人卵巢癌细胞系SKOV3,在该细胞系中NEDD4L表达水平相对较低,另外,还应用G418筛选建立了稳定转染NEDD4L真核表达载体及空载体的细胞系SKOV3-NEDD4L及SKOV3-Neo。RT-PCR检测可见:转染NEDD4L的细胞系中均可检测到特异性高水平NDEE4L条带,与预计大小符合,在2200b P。westemblot鉴定示,NEDD4L蛋白的表达在转染NEDD4L真核表达载体的细胞中较在相应的转染空载体的细胞及未转染细胞中明显较多。5.观察体外转染NEDD4L后对卵巢癌细胞生长及迁移形成能力的相互关系。活细胞计数结果示,SKOV3-NEDD4L细胞的增殖速度与对照组SKOV3及SKOV3-Neo相比明显减慢(P0.001)。转染后SKOV3细胞的形态变化SKOV3-NEDD4L组细胞的生长出现受抑制的特征,如细胞呈圆形,体积增大;细胞质蓝染,见较多空泡;细胞核为空泡状,可见2~3个核仁;86%的SKOV3-NEDD4L组细胞的细胞核与细胞质之比较SKOV3-Neo及SKOV3组细胞缩小;异染色质凝聚、线粒体退化。透射电镜观察可见,SKOV3-NEDD4L组细胞超微结构出现凋亡征象,即细胞体积增大、形态趋于一致、细胞核与细胞质之比缩小,细胞质空泡化,核膜清晰,蛋白酶原颗粒散在,核固缩,染色质有一定程度的聚集。划痕实验结果示,划痕24h后,SKOV3组细胞迁移距离为(147.6±14.7)μm,SKOV3-Neo组为(131.5±10.2)μm,SKOV3-NEDD4L组为(21.1±7.2)μm,SKOV3-NEDD4L组迁移距离明显短于SKOV3-Neo和SKOV3组(P0.05)。上述结果显示卵巢癌细胞中NEDD4L表达增加可有效降低细胞的迁移形成能力并抑制其生长。6.利用NEDD4L真核表达载体瞬时转染SKOV3细胞,并利用流式细胞术检测了NEDD4L过表达对细胞周期进程及细胞凋亡的影响,正如图8所示,在SKOV3、SKOV3-Neo、SKOV3-NEDD4L三组细胞中,NEDD4L的过表达可通过明显增加G2或S期的细胞数目诱导细胞周期的阻滞;此外,还可显著增加亚Gl期亚二倍体细胞的数目,提示NEDD4L可诱导卵巢癌细胞的凋亡。7.采用Annexin V/P丨双染。结果显示,NEDD4L真核表达载体经脂质体介导转染SKOV3细胞处理24h后,SKOV3-NEDD4L凋亡早期细胞数和凋亡晚期细胞数均有所增加(Q4:5.2±3.3%-7.6±1.2%,Q2:18.8±4.1%-35.9±6.4%),且多数细胞属Q2象限,说明作用24h后,NEDD4L能诱导SKOV3凋亡,且凋亡细胞多处于凋亡晚期。8.给裸鼠分别接种SKOV3、SKOV3-Neo、SKOV3-NEDD4L细胞。6~7天后,接种SKOV3-Neo、SKOV3细胞的裸鼠都可于腋下触及迅速生长的包块。然而,8只接种SKOV3-NEDD4L的裸鼠在3周内均未触及肿瘤包块,3周后也仅有2只可触及很小的包块。SKOV3-NEDD4L组平均肿瘤体积明显小于SKOV3组及SKOV3-Neo组(0.019±0.005cm3vs 0.897±0.207cm3or 0.409±0.378cm3,P0.01)。解剖已处死的裸鼠时,可在SKOV3组及SKOV3-Neo组的裸鼠中见较大瘤体且可见多个结节,但是SKOV3-NEDD4L组裸鼠中则未见上述情况。对瘤体进行免疫组化处理,结果显示,SKOV3-NEDD4L组的瘤体与SKOV3、SKOV3-NEO组相比,NEDD4L的表达较明显。研究结果揭示NEDD4L的表达增加可降低SKOV3细胞在裸鼠体内的成瘤力,并抑制肿瘤的生长。结论:1.NEDD4L蛋白的表达在正常组织、良性上皮性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌组织中逐渐降低,甚至表达缺失,提示NEDD4L蛋白表达降低或缺失可能与上皮性卵巢癌的发生发展有关。肿瘤的期别越晚、分化越差,NEDD4L蛋白的表达水平越低,提示NEDD4L蛋白表达受抑制可能与上皮性卵巢癌的恶性程度有关。NEDD4L蛋白异常表达可能与上皮性卵巢癌发生发展及侵袭转移有关。2.NEDD4L可明显抑制卵巢癌细胞体外增殖及转移能力。NEDD4L诱导卵巢癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的能力与其增殖抑制作用有关。NEDD4L在裸鼠体内,NEDD4L能降低卵巢癌细胞的成瘤能力并延长肿瘤的潜伏期。
[Abstract]:Objective: To study the expression of Nedd4L in epithelial ovarian cancer and the growth of ovarian cancer cell apoptosis, migration, invasion and other effects of biological behavior and related mechanisms, explore the target of gene therapy for ovarian cancer. Methods: 1. immunohistochemical technique was used to detect Nedd4L expression in normal ovarian tissues, ovarian benign tumor and ovarian tissue this kind of cancer in 2.; the relationship analysis of the characteristics of Nedd4L expression and clinical pathology of ovarian cancer patients by chi square test; 3. by Ka Plan-Meier analysis of Nedd4L expression and survival time of patients with a specific disease; 4. eukaryotic expression vector PC DNA3.1 by liposome transfection method containing Nedd4L (+) -Nedd4L import human ovarian cancer cell line SKVO3, using real time quantitative PCR, immunohistochemical staining and immunocytochemical staining to verify the expression of Nedd4L in ovarian cancer cells; 5. with Nedd4L really The eukaryotic expression vector PC (+) DNA3.1 scratch test -Nedd4L was transfected into human ovarian cancer cell line SKVO3, four, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method for the determination of cell viability; eukaryotic expression vector PC DNA3.1 containing 6. Nedd4L (+) -Nedd4L was transfected into human ovarian cancer cell line SKVO3, using flow cytometry Nedd4L recombinant expression vector after transfection, effects of Nedd4L on cell cycle and apoptosis of ovarian cancer cell growth in nude mice; 7. Nedd4L observed in vivo after transfection. Results: 1.NEDD4L was expressed in the cytoplasm, the dyeing depth as brown to yellow. In 10 cases of normal ovarian tissue was positive in 8 cases, 9 cases were positive in 10 cases of benign ovarian tumor, 25 cases of borderline ovarian tumors in 20 cases were positive, 72 cases of ovarian cancer and 32 cases of positive expression of NEDD4L in ovarian cancer group was significantly lower than in normal group, benign tumor group, the difference was significant (P0.01.2.) in 41 cases of early ovarian cancer ,NEDD4L闃虫，

本文编号：1459176