卵巢癌靶向PEG-PLA纳米嵌段共聚物的制备与应用的实验研究

发布时间：2018-01-29 17:10

本文关键词： 卵巢癌主动靶向性物理靶向性纳米载体叶酸　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在我国卵巢癌发病率位列于女性恶性肿瘤第五位,为女性病死率最高的疾病,卵巢癌严重危害女性健康。由于卵巢癌患者早期缺乏典型的症状和体征,因此绝大多数卵巢癌在确诊时已届晚期(FIGO III-IV期),患者的预后不良。晚期患者5年生存率不足400%。传统上早期卵巢癌患者以手术切除为主;晚期上皮性卵巢癌标准一线治疗方案是肿瘤细胞减灭术,新型辅助化疗术以及术后卡铂+紫杉醇联合化疗,但是约有70%以上的卵巢癌患者会复发;对于卵巢癌复发及耐药患者目前仍然缺乏有效的治疗手段。化学治疗是卵巢癌的主要辅助治疗手段,然而尽管新型化疗药物和化疗方案陆续投入临床使用,近几十年来患者的预后并未得到显著的改善。因此,亟需一种新的有效的治疗手段应用于临床,以期提高疗效改善患者预后。纳米技术的发展为恶性肿瘤的靶向治疗提供了新的思路,为卵巢癌的综合治疗提供了新的手段。纳米科技从在20世纪90年代初兴起到现在经历了飞速的发展,取得了令人瞩目的成果。目前纳米技术已经广泛的应用于航空航天、生物医学、材料等多个领域。在医药领域方面,载药纳米载体的出现和发展,为靶向抗肿瘤药物的研制提供了新的途径。纳米作为载体包裹难溶性药物,可以增加药物的溶解度,提高水溶性药物的稳定性,提高药物的生物利用度,减少药物的毒副作用。肿瘤组织生长迅速,大量新生血管产生,血管的通透性增加,同时肿瘤组织缺乏有效的淋巴引流,因此载药纳米载体对肿瘤组织具有增强的渗透性和滞留效应(EPR效应),从而达到对肿瘤组织的被动靶向及缓释作用;肿瘤组织无氧酵解增加,肿瘤局部呈现酸性环境,使用PH敏感性的生物可降解材料制备的纳米载体,使纳米载体选择性的在肿瘤部位降解释放药物,正常组织呈PH中性,因此纳米载体在正常组织中保持稳定,从而实现肿瘤的物理靶向性作用;将相应的配体或者是特异性的单克隆抗体与纳米载体通过物理或者化学键的方式相耦联,依靠靶向分子特异性识别肿瘤细胞表面的受体或者配体,提高载药纳米载体对肿瘤组织的选择性,减少载药纳米载体在周围组织中的聚集,实现了纳米载体的主动靶向性作用。基于纳米载体具有物理化学靶向性,被动靶向性和主动靶向性作用,载药纳米载体对于妇科肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。本课题主要内容以两亲性共聚物聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)-聚乳酸(Polylactic acid,PLA)为材料,连接具有主动靶向基团叶酸分子(Folic acid,FA),制备具有卵巢癌主动靶向性的纳米载体胶束,将上述两种纳米粒作为载体包裹国产二代光敏剂竹红菌乙素(HB),或者卵巢癌一线化疗药物紫杉醇,检测纳米粒径,电位变化以及透射电镜的纳米形态检测不同载药纳米载体的理化性质,纳米胶束的毒性实验和摄取实验从细胞水平上验证了该主动靶向性纳米载体的低毒性和肿瘤靶向性特点,体内药物组织分布情况和药代动力学证明了纳米载体具有缓释作用以及含有叶酸分子的载药纳米载体的主动靶向性特点;不同纳米组的抗肿瘤效果进一步证明了叶酸纳米载体的主动靶向性。本实验系统的利用了纳米载体的被动靶向性,物理PH靶向性,以及连接叶酸以后的主动靶向性充分证明了该载药纳米载体的缓释作用和肿瘤靶向性的特点。第一部分纳米嵌段PEG-PLA-NP和叶酸偶联纳米载嵌段PEG-PLA-FA-NP的制备及其理化性质的测定目的制备具有两亲性共聚物纳米嵌段聚乳酸-聚乙二醇(PEG-PLA),在此纳米嵌段氨基端偶联叶酸分子制备具有肿瘤主动靶向性的聚乳酸-聚乙二醇(FA-PEG-PLA)纳米嵌段,并对两种不同的纳米嵌段共聚物进行理化性质检测,评估其后续研究可行性。方法利用纯化的丙交酯在引发剂的作用下与环氧乙烷避光恒温反应24h后酸解,抽滤干燥得到聚乙二醇-聚乳酸(H2N-PEG-b-PLA-MMA)嵌段共聚物分子。在PEG-PLA氨基端偶联叶酸合成具有肿瘤靶向性的(FA-PEG-b-PLA-MMA)纳米嵌段,FA-PEG-b-PLA-MMA是由已经合成成功的PEG-PLA纳米嵌段与叶酸在DCC和NHS的介导下反应24h,透析干燥得到砖红色含有叶酸的纳米嵌段。通过粒径散射仪检测不同纳米嵌段的粒径大小和电位变化,利用透射电镜观察纳米粒的形态特点,核磁检测两种纳米载体的H离子证明是否成功将叶酸连接到PEG-PLA纳米嵌段上。结果成功制备PEG-PLA-NP和FA-PEG-PLA-NP两种嵌段共聚物纳米载体,两种纳米载体在透射电镜下观察,粒子呈球形,分散佳,粒径均在100-200纳米之间。PEG-PLA纳米载体的平均粒径为116.0nm,FA-PEG-PLA纳米载体平均粒径为124.Onm。核磁波谱显示叶酸成功连接到纳米嵌段上。结论成功制备了两种纳米嵌段共聚物,两种纳米嵌段载体性质稳定,粒径大小均匀,在120nm左右,纳米粒呈球形分布,分散佳。为后续包裹不同的药物提供了原材料。第二部分竹红菌乙素(HB)纳米载体的制备载药纳米载体理化性质性质检测以及抗肿瘤效应以及淋巴靶向性目的制备竹红菌乙素纳米载体以及含有叶酸的竹红菌乙素纳米载体胶束并对其理化性质进行检测,体内体外实验验证叶酸受体靶向纳米载体PEG-PLA-FA-NP对高表达叶酸受体的卵巢癌细胞系(SKOV3)或卵巢癌组织的主动靶向性作用,体外释放实验以及体内的药物组织分布实验和药代动力学实验均验证纳米粒的缓释作用。体外摄取实验以及体内肿瘤组织分布实验验证叶酸纳米载体的肿瘤主动靶向性。方法本课题通过不断优化纳米载体的制备,利用旋转蒸发透析法成功制备了HB-PEG-PLA-NP以及HB-FA-PEG-PLA-NP两种纳米载体胶束并对其理化性质进行检测。分别用透射电镜以及动态光散射仪测得不同的纳米胶束的形态特点,粒径的大小以及纳米胶束的电位情况。高效液相技术检测两种不同竹红菌乙素纳米载体胶束的包封率和载药量以及纳米胶束的体外释放情况,利用RT-PCR技术检测A2780,H08910,SKOV3三种不同卵巢癌细胞系中叶酸受体的表达情况,从而筛选出叶酸高表达细胞系,为后续实验的研究提供了理论依据。MTT检测不同纳米载体的细胞毒性作用,细胞摄取实验验证带有叶酸的纳米载体可以更多的被肿瘤细胞所摄取。建立动物模型,分别静脉注射不同剂型不同药物含量的溶液,本别于不同时间点处死荷瘤小鼠,利用HPLC技术检测不同组织中的HB含量,从而验证纳米的缓释效应以及肿瘤靶向性作用。结果1.成功制备竹红菌乙素纳米胶束,透射电镜检测两种纳米胶束中纳米粒呈球形,大小均匀,分散性好。HB-PEG-PLA-NP纳米粒径大小为137.8nm,Zate电位为-17.34mV,HB-FA-PEG-PLA-NP纳米粒径大小为145.9nm,Zate电位为-22.34mV.2.RT-PCR检测SKOV3细胞的叶酸受体表达丰度明显高于H08910和A2780细胞系。3.细胞的毒性实验中,相同剂量下,单纯HB溶液较两种竹红菌乙素载药纳米胶束溶液对于卵巢癌细胞系SKOV3的毒性弱,证明纳米载体携带竹红菌乙素可以提高药物的杀伤作用,不同浓度纳米嵌段共聚物PEG-PLA对卵巢癌细胞系SKOV3毒性较弱,证明该纳米载体作为一种安全的有效的纳米载体,具有临床应用价值。细胞摄取实验结果显示携带叶酸的纳米粒可以更多的被肿瘤细胞所摄取,由此证明,含有叶酸的纳米载体对于肿瘤细胞具有靶向性的作用。3.体外释放实验,体内药物代谢动力学分布情况以及药物组织分布情况均证明纳米载体的缓释效应。4.体外细胞摄取实验以及体内的药物组织分布实验均证明了肿瘤的靶向性作用。5.通过腹腔注射相同剂量的两种载药纳米载体胶束和单纯的竹红菌乙素溶液,于不同时间点处死家兔,观察家兔肠系膜淋巴结的变化,证明纳米嵌段作为一种有效的药物运输系统,具有淋巴结靶向性特点结论纳米胶束粒径大小均匀,性质稳定并且低毒性和高效性可以应用于体内抗肿瘤治疗,叶酸修饰的嵌段纳米共聚物对高表达叶酸的卵巢癌细胞和组织具有主动靶向性作用,叶酸受体介导的载药纳米载体可以使更多的药物进入卵巢癌肿瘤细胞和卵巢癌组织中,从而促进光敏剂HB在一定波长的刺激下对肿瘤细胞和组织产生杀伤作用。不同浓度的PEG-PLA载体作用于SKOV3细胞,MTT实验证明了 PEC-PLA纳米载体嵌段具有低毒性和缓释作用,可以作为药物的载体应用于临床。腹腔注射载药纳米载体后6h,家兔肠系膜淋巴结明显的增大,体内药物的组织分布,淋巴结中,两种纳米组药物含量较单纯药物组显著增高,由此证明了纳米载体具有淋巴靶向性特点。第三部分紫杉醇载药纳米粒的制备理化性质与体内细胞学实验目的制备紫杉醇纳米载体胶束(PTX-PEG-PLA-NP和PTX-FA-PEG-PLA-NP)并对其理化性质进行检测,MTT检测不同紫杉醇纳米载体胶束和单纯紫杉醇溶液对于卵巢癌细胞SKOV3的毒性作用,从而印证纳米嵌段作为一种有效的载体可以改善紫杉醇的低溶解性并且提高紫杉醇抗肿瘤效果,减少紫杉醇的毒副作用。细胞摄取进一步验证叶酸作为特异性分子能与卵巢癌细胞表面叶酸受体特异性结合实现肿瘤的主动靶向性作用。体外释放实验验证了载药纳米载体具有缓释效应。方法1.成功制备紫杉醇纳米胶束,透射电镜检测两种纳米胶束中纳米粒呈球形,大小分布均匀,分散较好。PTX-PEG-PLA纳米粒径大小为128.8nm,Zate电位为-35.4mV,PTX-FA-PEG-PLA纳米粒径大小为143.6nm,Zate电位为-42.53mV.2.细胞的毒性实验中,不同浓度的PEG-PLA-NP对于卵巢癌细胞的毒性随着浓度的升高毒性逐渐增加,但是当浓度到100ug/ml时,对肿瘤细胞的毒性在80%以上,证明纳米载体本身具有低毒性特点。单纯PTX溶液比相同药物含量的纳米胶束溶液对于卵巢癌细胞的毒性弱,达到相同的抗肿瘤效果,纳米载体组需要更少的药物,该纳米载体作为一种安全的纳米载体具有临床应用价值。3.细胞摄取实验证明,卵巢肿瘤细胞摄取更多的含有叶酸的纳米载体,证明了叶酸载药纳米载体具有肿瘤靶向性的作用。4.体外释放实验验证纳米载药在体外具有缓释效应,体内药物代谢动力学分布情况以及组织的药物分布情况证明纳米载体在体内具有缓释效应,纳米载体的缓释作用在体内体外均得到了证实。结论纳米胶束粒径大小均匀,性质稳定并且低毒性可以应用于体内,叶酸修饰的嵌段纳米共聚物对高表达叶酸的卵巢癌细胞和组织具有靶向性,叶酸受体介导的纳米载体使更多的紫杉醇进入肿瘤细胞和卵巢癌组织中,紫杉醇纳米载体可以在体内缓慢的释放出紫杉醇,使紫杉醇在体内发挥作用时间延长,减少紫杉醇的用量从而降低由于过度用药带来的药物毒副反应。PEG-PLA具有低毒性和缓释作用,因此该纳米载体可以作为药物的载体应用于临床。叶酸偶联的纳米载体具有肿瘤靶向性作用,以及肿瘤高效的杀伤作用,从而具有临床应用价值。第四部分紫杉醇的性质测定以及紫杉醇纳米载体的抗肿瘤效果检测目的紫杉醇不易溶于水,但是纳米载体的应用解决了紫杉醇这一弊端,载药纳米载体可以将紫杉醇包裹在嵌段之中,提高了抗肿瘤的效果,为了进一步检测不同药物组中各个组织中的紫杉醇含量,建立了紫杉醇的高效液相(HPLC)检测方法,以及皮下瘤裸鼠模型的建立。通过不同组静脉注射药物,观察皮下肿瘤的大小以及裸鼠的体重,从体外动物的层面上进一步证实了载药纳米载体具有抗肿瘤效果,该实验结果为紫杉醇用于卵巢癌的治疗提供了新的思路。方法1.紫杉醇理化性质检测(吸光度,标准曲线的制备,精密度实验,HPLC方法的制定)2.紫杉醇在不同组织中药物含量标准曲线的建立3.静脉注射三种不同种类的药物,于不同的时间点处死荷瘤小鼠,分别检测不同组织中不同时间点的紫杉醇含量,从而得出药物的组织分布情况。4.静脉注射不同组药物,分别测量皮下肿瘤的大小和荷瘤小鼠的体重,得出不同药物组抗肿瘤效果。结论紫杉醇浓度在10-70ug/ml时吸光度呈现较好的线性关系,根据紫杉醇日内和日间精密度结果证实紫杉醇性质较为稳定。紫杉醇在流动相(V乙腈:V水=1:1,柱温25℃,进样量为1ml/min的条件下所得的HPLC的峰较好,不同浓度出峰时间较为固定。浓度在2.5-35ug/ml时,呈线性分布。紫杉醇浓度-峰面积标准曲线为Y=180.085X+93.195(r=0.997)。各个组织的紫杉醇标准曲线符合线性回归,检测的峰型较好,可以与其他杂质的峰很好的分离出来,出峰的时间较为固定。体外释放实验以及药代动力学实验证明了纳米载体的缓释效应。体内组织学分布情况证明无论叶酸修饰与否,载药纳米载体体内紫杉醇药物含量均在6h时含量最高,而纯紫杉醇组紫杉醇峰时间在2h,由此结果可以得出,纳米载体在体内具有药物缓释作用。体内细胞毒性实验,肿瘤的药物组织学分布实验以及体内的抗肿瘤疗效实验均证明了叶酸的肿瘤主动靶向性特点。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

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