三羧酸循环酶CS和SDHB对卵巢癌生物学行为和mtDNA的作用研究

发布时间：2018-02-08 09:55

本文关键词： 卵巢癌 CS SDHB 增殖侵袭迁移耐药 mt DNA　出处：《上海交通大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：线粒体是存在于真核细胞的双层膜细胞器,主要功能是进行三羧酸循环和氧化磷酸化反应。几乎所有的喜氧生物都是以三羧酸循环-氧化磷酸化作为产生ATP的主要方式,为细胞的活动提供能量,因此线粒体被称为“细胞动力工厂”。线粒体基质中除包含三羧酸循环酶系、线粒体基因表达酶系,还包括线粒体DNA、RNA和核糖体。线粒体是高等动物细胞核外唯一含有DNA的细胞器,其中包含的人线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)是可独立于核DNA之外进行复制、转录和翻译的双链闭合环状分子。线粒体DNA可编码13个与线粒体氧化磷酸化有关的蛋白。当线粒体中三羧酸循环-氧化磷酸化通路异常时,例如三羧酸循环酶表达异常时,线粒体的能量代谢也会发生异常,进而影响细胞正常功能的实现。柠檬酸合成酶(Citrate synthase,CS)和琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)是参与三羧酸循环-氧化磷酸化的两个酶。其中CS是参与三羧酸循环的限速酶,催化形成产物柠檬酸用于后续三羧酸循环,或者转运至胞质用于蛋白质乙酰化和脂肪酸代谢;SDH是三羧酸循环中唯一的多亚基线粒体膜结合酶,包括A、B、C、D四个亚基,其中SDHB亚基(Succinate dehydrogenase subunit B)编码铁硫蛋白,参与构成酶活性区域,此外SDH还参与线粒体氧化磷酸化呼吸链电子传递。CS和SDHB均由核基因编码,参与线粒体能量代谢。目前,CS在恶性肿瘤中的表达和具体功能有不同的观点,研究报道胰腺癌和肾嗜酸细胞瘤中CS表达增加,而在多株宫颈癌细胞株中CS表达降低;SDH亚基突变能够引起多种肿瘤,SDH可能是一种肿瘤抑制基因。以上研究提示三羧酸循环酶在肿瘤发生中有重要作用。正常状态下,线粒体消耗的部分氧气会转化为超氧化物阴离子、过氧化氢和其他过氧化簇(reactive oxygen species,ROS)。与核DNA相比,由于线粒体DNA中无内含子和保护性组蛋白,使得mt DNA容易受ROS攻击,从而使DNA突变或者拷贝数发生变化。Mt DNA的这种改变会影响线粒体基因的表达和一系列线粒体的功能。因此mt DNA的异常改变进而会影响线粒体氧化磷酸化反应,甚至导致恶性生长状态。相反的,当机体三羧酸循环-氧化磷酸化异常时,机体会启动代偿机制和应急方式维持能量需求,线粒体DNA拷贝数的增加可能是一种代偿机制来应对线粒体呼吸功能异常。文献报道非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞中线粒体DNA的增加与肿瘤微小残留病/持续疾病状态(MRD/PD)相关,NHL化疗后存活的残余细胞中还检测到ATP相关酶CS的上调和SDH的下调,提示CS和SDH与mt DNA的拷贝数有一定关系。卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤,由于临床发现多是晚期而使死亡率较高。目前卵巢癌治疗的瓶颈仍是转移和耐药,寻找卵巢癌转移和耐药新机制以及探索治疗新靶点仍是重中之重。目前,仅有文献报道CS在鼠卵巢癌模型中活性增加,CS和SDHB在人卵巢临床标本的表达以及与mt DNA拷贝数的关系并未进行研究。基于上述基础,本课题针对CS、SDHB和mt DNA拷贝数在卵巢癌的表达进行研究,体外实验发现CS基因沉默抑制卵巢癌细胞(SKOV3,A2780)增殖、侵袭、迁移能力,增加化疗敏感性,降低mt DNA拷贝数;SDHB基因沉默促进卵巢癌细胞中上述恶性生物学行为,降低顺铂敏感性,提高mt DNA拷贝数。本课题分为三个部分:(1)CS对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究。(2)SDHB对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究。(3)CS和SDHB对卵巢癌细胞线粒体DNA相对拷贝数的作用研究。第一部分柠檬酸合成酶对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究研究目的:研究柠檬酸合成酶(CS)在卵巢肿瘤组织和卵巢细胞中的表达水平,探索其对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用和机制。研究方法:1.卵巢正常上皮细胞组织原代培养,实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测人卵巢肿瘤组织和卵巢细胞中柠檬酸合成酶m RNA和蛋白水平;2.设计合成干扰序列基因沉默CS,检测CS基因沉默对细胞能量水平的影响(ATP、AMPK/P38MAPK);3.检测基因沉默CS对卵巢癌细胞株增殖、侵袭和迁移的影响(CCK8实验、Transwell小室);Western blot检测增殖相关信号蛋白p-ERK、凋亡相关蛋白(Bcl-2,cleaved caspase 3)及细胞侵袭相关蛋白分子(p-FAK,MMP2,Vimentin)的变化;4.检测CS基因沉默对卵巢癌细胞耐药性的影响(转染组和对照组IC50值的变化、细胞凋亡水平、细胞克隆形成能力);DNA损伤修复角度探讨CS参与卵巢癌化疗耐药的机制:Western blot检测基因沉默前后卵巢癌细胞DNA损伤和修复能力的变化(ERCC1,γ-H2AX);5.基因芯片技术检测CS基因沉默前后基因水平变化,real-time PCR验证与耐药、凋亡和自噬相关基因(CASP7,IRF7,DDX58,ISG15,ATG12)的水平变化。研究结果:1.卵巢癌组织中柠檬酸合成酶表达水平较卵巢良性肿瘤组织高,卵巢癌细胞株SKOV3和A2780中CS水平较卵巢正常上皮细胞(HOSE)高;2.CS基因沉默前后细胞中ATP变化不明显(P0.05),而AMPK/P38 MAPK显著受抑制(P0.05);3.CS基因沉默降低卵巢癌细胞株SKOV3和A2780细胞增殖速度(P0.05),促进细胞凋亡(P0.05),同时显著抑制细胞的侵袭和迁移能力(P0.05);4.基因沉默CS明显降低了卵巢癌细胞对顺铂的24小时半数抑制浓度IC50值(P0.05),细胞凋亡水平增加,化疗药物顺铂处理后卵巢癌细胞的细胞克隆形成能力降低(P0.05);同时发现基因沉默CS后,细胞DNA损伤修复能力降低(ERCC1降低),DNA损伤增加(γ-H2AX增加);5.CS基因沉默明显增加CASP7,IRF7,DDX58,ISG15基因水平(P0.05),而ATG12水平降低,但不显著(P0.05)。结论:CS在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中高表达,基因沉默CS能够显著抑制卵巢癌细胞的增殖活性,显著降低卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力,也可以增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。CS通过影响ERK信号通路和细胞凋亡影响卵巢癌细胞的增殖活性,通过影响MMP2,p-FAK和Vimentin蛋白分子影响卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。CS沉默通过降低癌细胞DNA损伤修复能力、增加DNA损伤提高卵巢癌细胞的化疗敏感性。第二部分琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的作用研究研究目的:研究琥珀酸脱氢酶B亚基(SDHB)在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达水平。探索SDHB对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性的影响,并进一步研究其中的相关机制。研究方法:1.Real-time PCR和Western blot检测SDHB在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的表达水平;2.Western blot检测不同卵巢癌细胞株中SDHB蛋白水平;3.SKOV3和A2780细胞中琥珀酸脱氢酶B亚基基因沉默,检测基因沉默对细胞能量水平的影响(ATP、AMPK/P38MAPK);4.检测基因沉默SDHB对卵巢癌细胞株增殖、侵袭和迁移的影响(CCK8实验,Transwell小室);Western blot检测增殖相关信号蛋白p-ERK、凋亡相关蛋白(Bcl-2,cleaved caspase 3)及细胞侵袭相关蛋白分子(p-FAK,MMP2)的变化;5.观察基因沉默SDHB对卵巢癌细胞耐药性的影响(转染组和对照组IC50值的变化、细胞凋亡水平、细胞克隆形成能力);DNA损伤修复角度探讨SDHB参与卵巢癌化疗耐药的机制:通过Western blot检测基因沉默前后卵巢癌细胞DNA损伤和修复能力的变化(ERCC1,γ-H2AX);6.构建SDHB过表达质粒载体,转染SKOV3细胞进行功能回复实验(增殖、侵袭、迁移和化疗敏感性相关实验);7.从缺氧角度研究SDHB对卵巢癌影响的机制:检测SDHB基因沉默和过表达对缺氧诱导因子HIF-1α水平的影响;氯化钴诱导HIF-1α表达,检测SDHB与HIF-1α表达水平的关系。研究结果:1.SDHB在卵巢癌组织中表达低于正常卵巢组织(P0.05),而且m RNA水平在卵巢癌转移灶低于原发灶(P0.05);2.不同卵巢癌细胞株中SDHB表达水平不同;3.SKOV3和A2780细胞中SDHB基因沉默降低细胞中ATP水平,AMPK/P38 MAPK上调;4.SDHB基因沉默增加细胞增殖速度,促进卵巢癌细胞侵袭和迁移能力;5.随顺铂浓度增加,卵巢癌细胞中SDHB水平逐渐升高;基因沉默SDHB明显增加卵巢癌细胞对顺铂的IC50值(P0.05)、减低细胞凋亡水平,增强细胞的克隆形成能力(P0.05);基因沉默SDHB后,细胞DNA损伤修复能力增加,DNA损伤降低;6.过表达SDHB后,SKOV3细胞恶性生物学行为(增殖、侵袭、迁移、化疗敏感性)部分逆转;7.SDHB基因沉默增加HIF-1α表达,过表达SDHB降低HIF-1α表达,随HIF-1α表达增加SDHB水平降低。.结论:SDHB在卵巢癌组织低表达,尤其转移灶中更低。基因沉默SDHB能够增加卵巢癌细胞的增殖活性,促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力,也可以降低卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,而SDHB过表达可逆转上述恶性生物学行为。SDHB是通过影响HIF-1α表达而影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为,通过影响DNA损伤水平影响化疗敏感性。第三部分柠檬酸合成酶和琥珀酸脱氢酶B亚基对卵巢癌细胞线粒体DNA相对拷贝数的作用研究研究目的:研究线粒体DNA相对拷贝数(mt ND2/HBB)和线粒体转录因子A(TFAM)在卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤中的水平,探索CS和SDHB对线粒体DNA相对拷贝数的影响和相关机制。研究方法:1.Real-time PCR检测卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中线粒体DNA相对拷贝数和线粒体转录因子A水平;2.Real-time PCR检测卵巢癌组织和卵巢良性肿瘤组织中CS和SDHB基因水平;3.SKOV3和A2780细胞株分别基因沉默CS和SDHB,real-time PCR检测基因沉默前后mt ND2/HBB和TFAM的表达水平;4.从线粒体DNA生成角度分别探索CS和SDHB对线粒体DNA相对拷贝数的影响:Western blot检测ERK/P38 MAPK水平,real-time PCR检测基因沉默前后线粒体DNA合成相关因子PGC-1α水平。研究结果:1.卵巢癌组织中线粒体DNA相对拷贝数和TFAM显著高于卵巢良性肿瘤组织(P0.05);2.卵巢癌组织中CS基因水平显著高于卵巢良性肿瘤组织(P0.01),而SDHB基因水平卵巢癌组织显著低于卵巢良性肿瘤组织(P0.05);3.CS基因沉默降低显著卵巢癌细胞SKOV3和A2780中mt ND2/HBB水平(P0.05),TFAM水平也降低但是不显著(P0.05);SDHB基因沉默显著增加卵巢癌细胞中mt ND2/HBB水平(P0.05),而TFAM水平增加不显著(P0.05);4.CS基因沉默后SKOV3和A2780两株细胞中ERK和P38磷酸化水平显著降低(P0.05),同时PGC-1α基因水平降低但不显著(P0.05);SDHB基因沉默后两株细胞中ERK和P38磷酸化水平显著上调(P0.05),PGC-1α基因水平上调不显著(P0.05)。结论:卵巢癌组织中线粒体DNA相对拷贝数和TFAM水平均高于卵巢良性肿瘤组织,CS和SDHB表达水平影响卵巢癌细胞株线粒体相对拷贝数,可能是通过影响ERK/P38 MAPK通路实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31

【相似文献】