Let-7i调控卵巢癌细胞生物学行为及其作用机制的研究

发布时间：2018-02-15 22:18

本文关键词： 卵巢癌 let-7i 顺铂生物信息靶基因　出处：《武汉大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的:卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的疾病,因卵巢癌死亡的人数在女性因癌症死亡人数中居第五位,严重威胁着女性的生命和健康。卵巢癌的早期症状不明显,大部分的患者在确诊时已发展到肿瘤的晚期。目前,临床上针对卵巢癌的主要治疗手段是手术辅以化学药物治疗的联合治疗,但是70%以上的患者最终发展为化疗药物耐药导致治疗失败,导致卵巢癌晚期患者的5年生存率低于30%。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的结合,抑制靶基因翻译。let-7i作为miRNA家族重要一员,已被发现参与到多种类型肿瘤的发生发展、转移与耐药等过程中。本研究在分析let-7i在卵巢癌不同细胞中表达水平的基础上,通过在卵巢癌细胞中过表达let-7i,探讨其对细胞增殖、迁移侵袭以及顺铂敏感性等细胞生物学行为的影响;进一步对let-7i的靶基因进行预测、验证,并运用数据挖掘方法鉴定卵巢癌中的关键基因,以研究let-7i在卵巢癌发生发展中的作用及分子机制。方法:1.培养人永生化卵巢上皮细胞IOSE、卵巢癌SKOV3及其耐药细胞株SKOV3/DDP细胞,A2780细胞,并采用浓度递增法结合大剂量冲击法诱导建立A2780/DDP细胞。采用实时荧光定量PCR方法检测let-7i在上述细胞中的表达。2.利用脂质体转染法将 let-7i mimics、let-7i mimics control、let-7i inhibitor、let-7i inhibitor control分别转染细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测转染效率。CCK-8实验与EdU实验检测let-7i对卵巢癌SKOV3和A2780细胞增殖的影响,Transwell实验检测let-7i对卵巢癌SKOV3和A2780细胞迁移侵袭能力的影响,MTT实验检测let-7i对卵巢癌耐药SKOV3/DDP与A2780/DDP细胞顺铂敏感性的影响。3.采用TargetScan、miRanda和PicTar三种miRNA靶基因预测软件分析let-7i的靶基因,三种软件所预测的基因交集作为候选靶基因,利用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Disco very)数据库对靶基因集合进行 GO(Gene Ontology)分析以及基于 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)的信号通路分析,发现潜在的信号通路和关键调节基因。4.采用双荧光报告基因实验与western blot实验验证let-7i的靶基因和信号通路的影响,采用OvMark在线数据库进行靶基因表达的预后分析。5.利用GE02R鉴定三个卵巢癌mRNA表达芯片 GSE36668、GSE18520、GSE14407 中的差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEG),应用 STRING 构建 PPI(Protein-Protein Interaction)网络。利用 GE02R鉴定卵巢癌miRNA表达芯片GSE47841中的差异表达miRNA,应用miRecords软件预测miRNA的靶基因。筛选PPI网络中的核心基因,利用Kaplan-Meierplotter进行基因表达与卵巢癌患者生存联系的分析。结果:1.成功构建A2780/DDP卵巢癌耐药细胞;实时荧光定量PCR结果显示:与IOSE细胞相比,let-7i在SKOV3细胞与A2780细胞中表达显著下调(P0.01);let-7i在耐药细胞中表达显著下调(P0.01)。2.let-7i mimics转染细胞后,let-7i的表达水平显著升高(P0.01)。let-7i过表达后,CCK-8与MTT实验结果显示,SKOV3细胞与A2780细胞的增殖能力降低(P0.05),SKOV3/DDP细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)由 19.06lμmol/L 下降至15.52lnmol/L,A2780/DDP 细胞的 IC50 由 13.3Oμmol/L 下降至 8.33nmol/L;Transwell实验结果显示,SKOV3细胞与A2780细胞的迁移能力降低(P0.05),SKOV3细胞的侵袭能力降低(PO.O5)。3.TargetScan、miRanda和PicTar三种软件预测得到324个let-7i的潜在靶基因,应用DAVID数据库分析显示,let-7i靶基因显著富集于丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号通路(P0.05),其中包括TAB2等潜在靶基因。4.双荧光报告基因实验与western blot实验显示,let-7i过表达后,带有TAB2 3'UTR片段的报告质粒荧光强度明显下降(P0.05),SKOV3细胞与A2780细胞中TLR4与TAB2蛋白的表达降低(P0.05),而且let-7i能降低SKOV3细胞与A2780细胞中P38 MAPK途径的磷酸化水平(P0.05)。OvMark数据库分析显示,高表达的TAB2是影响卵巢癌患者生存时间的危险因素,总生存期与无病生存期明显降低(PO.O5)。5.GSE36668、GSE18520、GSE14407三种mRNA表达芯片中筛选得到345个异常表达基因。PPI网络共包含141个差异表达基因,其中16个核心基因,KM plotter分析结果显示,共有四个基因的高表达是卵巢癌生存时间的危险因素:CCNB1(HR 1.26,P=0.04),CENPF(HR 1.18,P = 0.014),KIF11(HR 1.15,P = 0.04),ZWINT(HR 1.15,P= 0.04)O结论:let-7i在卵巢癌细胞中表达下调,let-7i过表达可以抑制卵巢癌SKOV3细胞与A2780细胞的生长、迁移和侵袭能力,能够逆转顺铂耐药细胞SKOV3/DDP与A2780/DDP的耐药性。let-7i发挥上述抑制作用可能是通过下调其靶基因TAB2与TLR4的表达,抑制P38的磷酸化而实现。此外,通过数据库分析提示,CCNB1、CENPF、KIF11、ZWINT四种基因在卵巢癌中表达上调,并对卵巢癌预后的预测具有指导意义。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Ovarian cancer is the most common disease in ovarian cancer . The number of patients with ovarian cancer is the fifth in ovarian cancer . The effect of let - 7i on ovarian cancer cell proliferation , migration and resistance of ovarian cancer cells is investigated by means of real - time fluorescence quantitative PCR . Using GE02R to identify the target gene of ovarian cancer miRNA expression chip GSE47841 , the IC50 of let - 7i was decreased to 15.52lnmol / L . The IC50 of the cells was decreased from 13.3O 渭mol / L to 8.33 nmol / L . The results showed that the high expression of TAB2 was a risk factor affecting the survival time of ovarian cancer . The expression of KIF11 and ZWINT genes is up - regulated in ovarian cancer and has a guiding significance for predicting the prognosis of ovarian cancer .

【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

【参考文献】