AQP7和AQP9在PCOS患者颗粒细胞和卵母细胞中的表达及功能研究

发布时间：2018-02-20 17:38

  本文关键词： 多囊卵巢综合征 AQP7 AQP9 胰岛素抵抗 卵泡发育 颗粒细胞　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)在我国育龄期女性发病率为5%~10%,是一种合并糖代谢紊乱与生殖功能障碍的复杂疾病,目前其发病机制尚不清楚。研究认为PCOS可能是由于遗传基因变异与不良环境相互作用所致,是一种较复杂的多基因遗传病。而且其引起的排卵障碍性不孕症却是生殖领域面临的难题之一。虽然辅助生殖技术已经是治疗PCOS性不孕症的常规方法,但是由于其糖代谢和内分泌紊乱导致的卵泡发育异常,常常出现PCOS患者在行体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)过程中卵子成熟度和胚胎质量差,导致卵子利用率和胚胎种植率降低。而且PCOS患者常出现月经紊乱、不孕和肥胖等,后期患心血管疾病和2型糖尿病的发病几率也明显增加,严重威胁患者的生理及心理健康。因此,明确PCOS患者卵泡发育不良的机制是亟待解决的问题,是目前生殖领域的研究热点。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一组存在于细胞膜上的小分子蛋白家族,可使细胞膜对水的通透性增加,对维持细胞内外的水平衡意义重大。目前研究者已发现有11种AQPs(AQP0-AQP10)丰富地表达于哺乳动物多种组织细胞中,并参与精子发生、卵泡发育成熟、囊胚形成、胚胎着床等多种生殖过程,其在生殖领域的作用已经越来越受到关注。其分为三类亚家族:第一类即经典水通道蛋白:包括AQP0-2、AQP4-6和AQP8,对水具有高度选择性,主要负责水分子的运输;第二类是综合型水通道,包括AQP3、AQP7、AQP9和AQP10,可以运输水、尿素和甘油等一些中性小分子物质,又称为甘油-水通道蛋白。第三类是超级水通道蛋白,包括AQP11和AQP12,目前其结构和功能研究还不明确。早期的研究显示:AQP1-4 mRNA在人类不同发育时期卵泡颗粒细胞中的表达量不同。最近研究显示:正常女性的颗粒细胞中只有AQP1、7、9、11和12mRNA表达,而且AQP7mRNA的表达水平和受精率呈正相关,推测AQP7的表达可能是正常卵泡生成和健康卵母细胞的标志物。谭雅静等研究发现,AQP7在小鼠和正常人卵母细胞中表达,且可以提高玻璃化冷冻卵母细胞复苏后的存活率。有研究显示在肥胖女性与贫困妇女相比,肥胖女性的AQP7的表达水平较低,mRNA水平与BMI呈负相关。也有学者报道PCOS患者大网膜脂肪组织中AQP7mRNA和蛋白表达显著高于对照组,且与空腹胰岛素水平呈现正相关性,推测PCOS脂肪组织中的AQP7过表达可能与胰岛素敏感性及维持全身葡萄糖稳态有关。以上研究结果提示AQP7在甘油转运和能量代谢过程中起重要作用。但是,AQP7在PCOS患者颗粒细胞和卵母细胞的表达及其与胰岛素的相关性,目前尚未见报道。研究证实在卵泡发育过程中,AQP9表达于窦状卵泡和颗粒细胞中。而AQP9在PCOS患者中表达目前结论也尚存争议:有研究报道在PCOS患者和对照组的颗粒细胞中均检测到AQP9mRNA表达,两者之间无显著差异;但是也有学者报道AQP9mRNA表达水平在PCOS组明显低于正常组。在动物实验方面:最近研究发现在绵羊卵巢组织玻璃化冷冻过程中,AQP9对维持卵泡细胞内外的稳态至关重要。有学者报道AQP3,8和9mRNA在小鼠成熟卵母细胞中表达;也有研究发现AQP9mRNA在大鼠卵母细胞成熟过程中逐渐消失。以上研究结果提示AQP9可能在卵母细胞成熟的过程中起重要作用。但是,AQP9在PCOS患者颗粒细胞和卵母细胞的表达及其与胰岛素的相关性尚需研究进一步证实。综上所述,深入研究AQP7和AQP9在PCOS患者卵泡发育中的作用及功能研究不仅有助于PCOS发病过程中的病理生理研究,也将为其临床诊治提供新的思路。目的:本研究采用Real-time qPCR和Western-Blot等分子生物学方法检测PCOS组和对照组颗粒细胞中AQP7和AQP9的表达,探讨其在各组颗粒细胞中的表达特点;通过检测各时期卵母细胞中AQP7和AQP9的定位,探讨其对卵母细胞发育成熟的影响;通过添加不同浓度胰岛素及不同处理时间对体外培养正常人壁层颗粒细胞进行干预,探讨胰岛素对颗粒细胞中AQP7和AQP9表达的调控作用。方法:1.将收集到的各组卵巢组织做成病理切片,取出一部分行HE染色,镜下观察组织结构并拍照,比较各组卵巢结构特点;另一部分采用免疫组化法比较各组卵巢组织AQP7和AQP9分布情况及积分光密度值(integrated optical density,IOD)。2.分组:分为PCOS组和对照组。不同方法检测各组壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞中AQP7和AQP9表达水平。采用Real-time qPCR技术检测各组AQP7和AQP9基因表达水平;采用Western-Blot技术检测各组AQP7和AQP9蛋白的表达。3.采用免疫荧光技术检测各时期卵母细胞中AQP7和AQP9的定位,探讨其在卵母细胞发育过程的作用。4.体外培养正常人壁层颗粒细胞,分别添加不同浓度胰岛素及不同处理时间进行干预,检测干预后AQP7和AQP9基因及蛋白的表达变化,探讨胰岛素对颗粒细胞中AQP7和AQP9表达的调控。结果:1.AQP7蛋白及mRNA在PCOS组卵巢组织和各层颗粒细胞中的表达均明显高于对照组(P0.05);AQP7蛋白定位于人类各时期卵母细胞的细胞浆和细胞膜上。2.AQP9在PCOS组卵巢组织中的表达显著高于对照组(P0.05);而在PCOS组各层颗粒细胞中的表达显著低于对照组(P0.05);AQP9蛋白定位于人类各时期卵母细胞的细胞浆和细胞膜上。3.随着胰岛素浓度的增加,与对照组相比,AQP7和AQP9 mRNA和蛋白的表达呈现下降趋势。当胰岛素浓度为100nmol/L时,其表达量下降最明显,差异有统计学意义(P0.05)。4.100nmol/L胰岛素作用于正常体外培养的颗粒细胞6~24h后,与对照组相比,AQP7和AQP9在12h表达量最低(P0.05)。结论:1.AQP7在PCOS患者卵巢组织和颗粒细胞中均高表达及在各期卵母细胞中表达,提示AQP7可能参与PCOS患者卵泡的生长发育过程。2.AQP9在PCOS患者卵巢组织中高表达而在颗粒细胞中低表达,且表达于各期卵母细胞中,提示AQP9可能参与PCOS患者卵泡的生长发育过程。3.AQP7和AQP9表达与胰岛素呈浓度负相关;100nmol/L胰岛素作用12h AQP7和AQP9表达量最低,提示胰岛素可能通过调控AQP7和AQP9的表达影响卵泡的发育。
[Abstract]:The pathogenesis of polycystic ovary syndrome ( PCOS ) is 5 % 锝，

本文编号：1519590