BRIT1基因在宫颈癌中的作用及其机制研究
发布时间：2018-02-22 19:25
本文关键词： BRIT1 细胞增殖 细胞周期 细胞凋亡 慢病毒 出处：《重庆医科大学》2014年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：背景：BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)，起初是作为人类端粒酶逆转录酶（hTERT： human telomerase reversetranscriptase component）抑制子而被证实，又称MCPH1(microcephalin)。现研究证实BRIT1参与DNA损伤应答，维持染色体的完整性。此外，有研究表明BRIT1在多个肿瘤组织表达缺失，如卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌等。这些结果表明BRIT1可能在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。当前，，BRIT1在宫颈癌组织中的表达及其作用尚未得到证实，故本论文主要研究宫颈癌组织标本中BRIT1的表达和BRIT1对宫颈癌细胞增殖、周期、凋亡等生物学行为的影响及其机制。 第一部分：BRIT1在宫颈标本中的表达分析 目的：检测宫颈癌组织和配对的宫颈非癌组织中的BRIT1表达情况，比较两者之间的表达差异。 方法：应用real-time PCR，免疫组织化学技术及western blot等方法检测宫颈癌组织及其配对的宫颈非癌组织中BRIT1mRNA和蛋白水平的表达；并统计分析免疫组织化学检测的BRIT1的表达量与病人年龄、肿瘤大小、肿瘤类型、肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。 结果：Real-time PCR结果揭示：31例标本中的19例（61.3%）宫颈癌组织中BRIT1mRNA的表达水平低于配对的宫颈非癌组织中的表达；免疫组织化学技术结果揭示：63例标本中的44例（69.8%）宫颈癌组织BRIT1蛋白的表达低于配对的宫颈非癌组织中的表达；统计分析表明在高级的病理分级（1vs.3，P=0.013；2vs.3，P=0.047）和临床分期（0vs. Ⅲ，P=0.043）中，BRIT1蛋白的表达减少更为明显，与患者年龄、肿瘤大小与类型无相关性；western blot检测表明6例宫颈癌组织中BRIT1蛋白的表达均低于配对的宫颈非癌组织中的表达。 结论：与宫颈非癌组织比较，BRIT1在宫颈癌组织中的表达减少。BRIT1基因在宫颈癌癌组织和非癌组织中的表达差异提示BRIT1可能在宫颈癌的发生发展中具有一定的作用。 第二部分：人BRIT1基因重组慢病毒质粒的构建及慢病毒的制备 目的：构建人BRIT1基因重组慢病毒质粒，并包装成慢病毒颗粒。 方法：将BRIT1基因和慢病毒pLenO-DCE质粒经酶切反应，T4DNA连接酶连接反应，构建重组质粒pLenO-DCE-HA-BRIT1；然后重组质粒经常规PCR、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和DNA测序等鉴定后，用Lipofectamine2000将重组质粒和慢病毒包装质粒系统（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共转染到293T细胞中，包装成重组慢病毒颗粒，经流式细胞术测定重组慢病毒滴度。 结果：经常规PCR、琼脂糖凝胶电泳、限制性酶酶切和DNA测序鉴定，成功构建了BRIT1重组慢病毒质粒pLenO-DCE-HA-BRIT1；经293T细胞包装后，成功获得病毒滴度为1.24109TU/ml的重组慢病毒Lent-BRIT1。 结论：为进一步建立BRIT1过表达的宫颈癌细胞株，研究BRIT1对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其机制奠定了基础。 第三部分：BRIT1过表达对宫颈癌细胞增殖、周期、凋亡、侵袭与转移的影响 目的：研究BRIT1过表达对宫颈癌细胞（HeLa、SiHa和CaSki）增殖、周期、凋亡、侵袭与转移等生物学行为的影响。 方法：慢病毒感染宫颈癌细胞（HeLa、SiHa和CaSki）后，用荧光显微镜观察重组慢病毒Lent-BRIT1的感染效率；用real-time PCR和western blot等技术检测BRIT1mRNA和蛋白水平的表达；用免疫荧光细胞化学技术检测BRIT1蛋白的表达及亚细胞定位；用MTS测定细胞增殖能力；用流式细胞术测定细胞周期分布和凋亡情况；用划痕实验和trans-well实验测定慢病毒感染SiHa细胞后的细胞转移与侵袭能力。 结果：慢病毒Lent-BRIT1感染HeLa、SiHa、CaSki细胞72h后，荧光显微镜观察显示Lent-BRIT1对三株细胞的感染效率均大于95%；与阴性对照组（Lent-control）和未处理组（W/O）比较，HeLa、SiHa和CaSki细胞的重组慢病毒组（Lent-BRIT1）中BRIT1mRNA和蛋白的表达明显增加，且BRIT1蛋白主要分布在细胞核内，与W/O组中的分布一致；慢病毒Lent-BRIT1介导的BRIT1过表达能显著地抑制HeLa、SiHa、CaSki细胞的增殖，阻滞细胞周期在S期，并诱导细胞凋亡；此外，Lent-BRIT1介导的BRIT1过表达能显著地抑制SiHa细胞的转移与侵袭能力。 结论：重组慢病毒Lent-BRIT1能高效地感染HeLa、SiHa、CaSki细胞，并能显著地介导BRIT1基因过表达；BRIT1过表达阻滞细胞周期在S期，诱导细胞凋亡，从而抑制宫颈癌细胞（HeLa、SiHa和CaSki） 的增殖。第四部分：BRIT1过表达对宫颈癌细胞周期和凋亡影响的机制研究 目的：初步探明BRIT1过表达阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡的分子机制。 方法：提取慢病毒感染SiHa细胞72h后的蛋白，用western blot方法检测细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关因子。 结果：BRIT1过表达上调p53、p21的表达，下调CyclinA2、CyclinB1、CDC2、CDC25C等细胞周期相关蛋白的表达；此外，Lent-BRIT1组细胞中，凋亡诱导因子Bax的表达上调，凋亡抑制因子Bcl-2表达下调，线粒体中细胞色素C（Cyt C）表达减少，细胞胞浆中Cyt C检测增加，caspase-3和PARP-1剪切激活。 结论： BRIT1可能调控p53/p21、 cyclinA2/CDK2、CDC25C-cyclinB/CDC2信号通路，从而阻滞宫颈癌细胞S/G2期转化和G2/M期转化，即阻滞细胞周期在S期。此外，BRIT1通过启动线粒体凋亡途径，激活Caspase3，诱导宫颈癌细胞凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND : BRIT1 ( BRIT1 ( BRCT - repeat inhibitor of hTERT expression ) has been proved to be a human telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . It is shown that BRIT1 plays an important role in the development of human telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . The First Part : Expression Analysis of BRIT1 in Cervical Specimens Objective : To compare the expression of BRIT1 in cervical carcinoma with cervical carcinoma and to compare the expression of BRIT1 . Methods : The expression of BRIT1mRNA and protein was detected by real - time PCR , immunohistochemistry and western blot . The relationship between the expression of BRIT1 and the age , tumor size , tumor type , pathological grade and clinical stage was analyzed . Results : The results of real - time PCR showed that the expression level of BRIT1 mRNA was lower in 19 cases ( 61.3 % ) in 31 cases than that in the paired cervical non - cancerous tissues . The results of immunohistochemistry showed that the expression of BRIT1 protein was lower in 44 cases ( 69.8 % ) in 63 specimens than in the paired cervical non - cancerous tissues . Statistical analysis showed that the expression of BRIT1 protein was not correlated with the age of the patient , the size and type of tumor . Western blot analysis showed that the expression of BRIT1 protein in 6 cervical cancer tissues was lower than that in the paired cervical non - cancerous tissue . Conclusion : The expression of BRIT1 gene in cervical cancer tissues and non - cancerous tissues suggests that BRIT1 may play a role in the development of cervical cancer . Second part : construction of human BRIT1 gene recombinant lentivirus plasmid and preparation of lentivirus Objective : To construct the recombinant lentivirus plasmid of human BRIT1 gene and to package it into slow virus particles . Methods : The recombinant plasmid pLeno - DCE - HA - BRIT1 was constructed by restriction enzyme digestion and T4 DNA ligase reaction of BRIT1 gene and slow virus pLeno - DCE plasmid , then the recombinant plasmid was co - transfected with recombinant plasmid and lentivirus packaging plasmid system ( pRsv - REV , pMDlg - pRRE , pMD2G ) by conventional PCR , agarose gel electrophoresis , restriction endonuclease digestion and DNA sequencing . Results : The recombinant lentivirus Lent - BRIT1 was successfully constructed by conventional PCR , agarose gel electrophoresis , restriction enzyme digestion and DNA sequencing . Conclusion : To further establish the BRIT1 overexpression cervical cancer cell line , the influence of BRIT1 on the biological behavior of cervical cancer cells and its mechanism are established . Part 3 : Effects of overexpression of BRIT1 on proliferation , cycle , apoptosis , invasion and metastasis of cervical cancer cells Objective : To study the effects of BRIT1 overexpression on the proliferation , cycle , apoptosis , invasion and metastasis of cervical cancer cells ( HeLa , SiHa and Cavaliantly ) .
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