端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究

发布时间：2018-02-23 08:03

本文关键词： hTERT VEGF 宫颈癌浸润 shRNA干扰　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：子宫颈癌(Cervical cancer)是女性生殖系统最常见恶性肿瘤之一,全世界每年新发病例约为50万,80%以上在发展中国家,已成为发展中国家女性的主要致死性疾病。临床上尚无子宫颈癌高效特异、预后良好的治疗手段。特别是子宫颈癌组织浸润、远处转移等问题严重阻碍了患者的手术治疗,也是后期患者肿瘤复发、预后差的主要原因,严重地降低了患者的存活率。因此,深入研究子宫颈癌浸润、转移的高危因素,探索宫颈癌细胞侵润的分子机制,将有助于子宫颈癌特效治疗手段的研发。现有研究已发现,部分生物学因素与子宫颈癌的发生发展有关。HPV感染与宫颈癌的发病率存在很强的关联性,但不是所有病毒感染人群都会进展为宫颈癌,提示其他因素也能影响宫颈病变的发展进程。人端粒酶是现阶段临床实验室检测肿瘤常用的肿瘤标志物;其由三个部分组成,分别是人端粒酶逆转录酶(h TERT)、人端粒酶RNA组分(h TERC)和端粒酶协同蛋白(h Tpl);已经发现端粒酶h TERT m RNA的激活与宫颈癌病变的严重程度有明显相关性。同时,HPV持续感染引起人体组织的慢性炎症,分泌种类繁多、作用各异的炎症因子,包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF,这些炎症因子会促使正常细胞的变性,最终可能导致肿瘤的发生。但这些生物学因素与宫颈癌浸润、转移是否有关尚未明确。基于此,本研究首先从子宫颈癌关系密切的临床高危因素出发,使用相关性分析探索与细胞浸润密切相关的生物学因素,包括HPV病毒、端粒酶以及炎症因子等,试图从大体上明确影响宫颈癌浸润的高危因素;然后,进一步使用分子生物学手段确定这些相关因素与宫颈癌浸润之间的相互作用关系;最终明确导致宫颈癌浸润、转移的生物学因素,加深对宫颈癌发生发展机制的理解,为子宫颈癌特效治疗手段的研发奠定基础。具体研究分为下列三个部分:第一部分子宫颈癌浸润与HPV感染、端粒酶、炎症因子等相关高风险因素的相关性分析目的:探索与子宫颈癌浸润密切相关的生物学因素。方法:收集正常宫颈组织(NCE)20例,宫颈上皮内瘤样病变II以上(CIN II或III)20例及宫颈鳞癌组织(SCC)20例。PCR法检测上述各种组织中HPV的感染情况;TRAP-PCR法检测组织中端粒酶活性水平;ELISA法检测宫颈鳞癌和正常宫颈组织中炎症因子(VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β)的表达情况。实验结果及其他临床高危因素分别与宫颈癌发展浸润程度进行相关性分析。结果:CIN和SCC组织均为高危HPV(HPV-16和18)阳性,部分正常组织也为高危HPV阳性。端粒酶活性及h TERT m RNA在宫颈癌、CINⅡ以上病变中明显异常扩增,但是在正常宫颈组织中几乎不出现异常扩增;且h TERT m RNA异常表达水平与宫颈病变的严重程度呈显著正相关(p0.0001)。在六个代表性的炎症因子中,VEGF-A及其m RNA表达水平与宫颈病变程度正相关(p0.001)。而且VEGF-A与端粒酶水平见存在正相关。结论:癌症组织端粒酶及炎症因子VEGF-A分别与宫颈癌浸润程度高度正相关。第二部分VEGF对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响目的:研究VEGF-A对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响。方法:选取体外培养宫颈癌Hela细胞株,依据RNAi原理,获得针对VEGF-A基因的si RNA,并转染体外培养的Hela细胞。观察其能否特异、高效的抑制细胞中VEGF-A基因及蛋白的表达,及其对Hela细胞增殖能力的影响。结果:利用si RNA技术成功的抑制了Hela细胞株中VEGF-A基因及蛋白的表达,同时Hela细胞在生长、增殖能力有明显的抑制。结论:VEGF-A参与了宫颈癌Hela细胞株的生长增殖。第三部分端粒酶对宫颈癌hela细胞VEGF-A分泌的影响及其机制研究目的:本实验通过体外实验研究端粒酶h TERT与VEGF在人乳头状瘤病毒阳性宫颈癌细胞的关联性,了解宫颈癌侵润发展的潜在分子机制。方法:分别采用q RT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA检测多种宫颈癌细胞系端粒酶和端粒酶h TERT(端粒酶的限速基因),VEGF m RNA和其蛋白的表达水平。为了探寻端粒酶对宫颈癌细胞VEGF-A分泌的作用,分别构建h TERT sh RNA质粒和过表达质粒用于He La细胞端粒酶的抑制和过表达实验。同时研究HPV E6和E7在端粒酶影响VEGF表达中的作用。结果:Hela细胞的端粒酶和VEGF表达水平都很高,且两者间存在正相关,可用于后续实验。抑制h TERT表达下调Hela细胞VEGF的表达,而h TERT的过表达则上调HPV-18阳性细胞VEGF的表达。此外,HPV E7癌基因蛋白在端粒酶上调VEGF过程是一个必要条件。结论:端粒酶不直接影响宫颈癌细胞的浸润和转移;但它可通过HPV E7蛋白影响VEGF的表达,间接促进宫颈癌细胞浸润。本研究探索了宫颈癌浸润与转移的发生机制,进一步明确了宫颈癌的发病机制,同时为宫颈癌的干预治疗奠定了理论基础。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

【参考文献】