PARP-1和EMT在卵巢癌中的生物学功能及意义

发布时间：2018-03-05 11:33

本文选题：卵巢癌　切入点：PARP-1　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景妇科恶性肿瘤中,卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,是女性生殖系统第三大恶性肿瘤,但其死亡率却居第一位。当卵巢癌患者以腹水或盆腔包块就诊时,大多数已经是临床晚期。卵巢癌减灭术合并铂类、紫杉醇为主的联合化疗是当今治疗卵巢肿瘤的主要临床手段。目前,卵巢癌的复发及化疗耐药成为困扰临床的主要障碍。卵巢癌患者对铂类为主的联合化疗初次敏感性达85%,但大多数患者最终因化疗耐药而导致复发。卵巢癌化疗耐药尤其是铂类耐药的发生机制及逆转途径已经成为目前重要的研究课题。因此,降低患者复发率,逆转化疗耐药,卵巢癌化疗耐药相关机制的研究成为目前的首要任务。近年,肿瘤化疗耐药的研究已经取得重要进展,耐药机制主要包括DNA损伤修复能力的增强,耐药蛋白的过度表达和细胞内一些蛋白酶的改变引起细胞解毒功能增强等。目前肿瘤细胞的耐药机制主要归因于DNA损伤修复能力的增强。聚酰苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly-ADPribose polymerase-1,PARP-1)是存在于绝大多数真核细胞的细胞核中的蛋白质翻译后修饰酶,是PARP家族中在体内含量最多也最具特异性的成员。PARP-1位于染色体lq41～42区,包含有23个外显子。PARP-1蛋白的分子量为116KDa,包含1014个氨基酸。通过对细胞内众多蛋白质和酶进行翻译后修饰,从而调节细胞内一系列分子事件。在DNA复制、DNA的损伤修复、控制细胞的增殖分化凋亡、维持基因组的稳定等方面,PARP-1发挥着重要作用。静息状态下,PARP-1在细胞内以非活性状态存在。PARP-1对DNA的损伤异常敏感,当出现辐射、化疗药物等致使DNA损伤后,损伤的DNA游离断端将会激活PARP-1,活化的PARP-1检测到游离的DMA末端并与之结合,迅速募集与DNA损伤修复相关的蛋白到目标位点,进一步激活并催化蛋白受体聚ADP核糖基化,ADP核糖基化与组蛋白H1、H2B结合后,核小体的正常结构受到影响,进一步引起染色体结构松弛,损伤部位易于结合DNA修复酶,从而参与断链DNA的损伤修复。然而当存在DNA广泛损伤时,PARP-1可促进细胞凋亡。研究显示,沉默PARP-1基因或应用PARP抑制剂能有效提高卵巢癌耐药细胞对顺铂药物的化疗敏感性。在上皮来源的恶性肿瘤细胞侵袭转移的过程中,上皮间质转化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)发挥了重要作用。EMT是具有极性的上皮细胞转换成为间质细胞并使其发生侵袭转移的过程,在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用。EMT不仅在肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用,并且与肿瘤化疗耐药也可能存在一定的相关性。肿瘤细胞的EMT主要表现为上皮细胞的极性丧失及间质细胞具备迁移浸润能力。它降低了细胞之间的黏附力、增加了细胞迁移和浸润能力,不仅参与胚胎发育、组织重建、慢性炎症等过程,也是肿瘤浸润转移和多种纤维化疾病的重要机制之一。正常组织的上皮细胞整齐排列,为具有极性的单细胞层,细胞之间黏附紧密而规律,整齐地附着于基底部的细胞外基质上。间质细胞形态不规则,没有极性且细胞间黏附松散,由于细胞间黏附性小且无附着部位,因此具有迁移浸润能力。肿瘤细胞可通过EMT获得间质细胞表型,从而实现对周围组织的侵袭浸润。肿瘤细胞EMT过程中伴有:1.细胞形态学改变,上皮细胞失去极性和细胞间黏附力,变成不规则、松散排列的间质细胞;2.细胞表面标记分子表达改变:如上皮细胞标记蛋白E-cadherin、层连蛋白等表达下调;间质细胞标记蛋白如vimentin、纤维蛋白和SMA等表达上调;同时活化Snail、Twist、Slug等转录调控因子。这些改变导致上皮细胞失去极性和细胞间黏附力,从而导致细胞内肌动蛋白骨架重组。3.细胞生物学行为改变:上皮细胞由静止状态变为迁移浸润能力较强的间质细胞,并获得侵袭、抗凋亡能力的间质表型。有研究发现EMT减低了非小细胞肺癌组织对顺铂和紫杉醇的敏感性,由此推断参与EMT的相关因子及信号通路的激活或失调在肿瘤侵袭转移和化疗耐药的过程中起协同作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MARK)通路是 EMT过程中的重要信号转导通路之一,参与调节细胞的生长、增殖、分化及恶性转化等许多生物学效应。MARKs家族包括许多成员,其中在细胞信号转导通路中发挥重要作用的有3种:JNK、p38、ERK。既往研究显示,PARP-1抑制剂PJ34可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高C13*细胞对顺铂化疗药物的敏感性。磷酸化的ERK2激活PARP-1的途径不同于DNA受损引起的PARP-1活化,由此推断ERK2可调控PARP-1表达。由于激活PARP-1与ERK1/2具有相似的信号转导途径,有研究证实在没有DNA损伤的情况下,PARP-1可被磷酸化的ERK1/2激活。PARP-1在没有DNA损伤的情况下被pERK2激活是由于ERK2的磷酸化,而不依赖激酶的活性。pERK2直接作用于某些ERK2的底物使其活化而不依赖激酶的活性。由此我们推断,MAPK通路因子与PARP-1共同参与EMT,从而影响肿瘤细胞的化疗耐药。间质细胞标记蛋白波形蛋白(vimentin)和上皮细胞标记蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)被认为是EMT过程中关键的标志性分子。Vimentin作为真核生物细胞中主要的中间纤维,与微管、微丝共同构成细胞支架而维持细胞的完整性。除了维持细胞的完整性以外,vimentin的主要功能还包括:①参与细胞侵袭和转移;②参与细胞内外信号的传导;③参与细胞凋亡的调节;④参与基因组DNA表达的调控。其表达与肿瘤浸润转移呈正相关,表达越高,愈后越差。作为EMT、EndoMT的标志性分子,vimentin在肿瘤细胞中的表达都较正常组织高很多。Vimentin在EMT过程中作为重要的上游调节因子发挥关键作用。其表达与肿瘤浸润转移呈正相关,表达越高,愈后越差。作为上皮细胞连接的黏附剂,E-cadherin表达减少或沉默表达可致上皮细胞离散、失去极性,这提示E-cadherin与肿瘤的侵袭转移呈负相关,其可作为肿瘤的抑制因子,E-cadherin的表达减少或沉默表达与EMT的进展存在密切关系。E-cadherin的表达下调与Vimentin的表达升高相关,Vimentin的表达会干扰E-cadherin介导的细胞黏附。在早期卵巢癌中,E-cadherin的表达增加而不是减少。但是,一旦卵巢癌发生转移,转移腹水细胞显示,其E-cadherin的表达比原发肿瘤细胞中的表达显著减少。卵巢癌化疗耐药的过程中,PARP-1是否通过与EMT共同作用,影响其化疗耐药,以及对卵巢癌化疗耐药细胞生长、侵袭的作用,本文做了进一步研究。第一部分PARP-1抑制剂PJ34、ERK抑制剂U0126对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3生长、侵袭的作用实验目的:通过卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3中分别加入PARP-1抑制剂PJ34和ERK1/2抑制剂U0126,检测细胞的侵袭能力,及E-cadherin和vimentin的表达,以探讨在卵巢癌顺铂耐药细胞中PJ34、U0126与EMT的相互作用机制及对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3生长、侵袭的作用。实验方法:PJ34、U0126干扰卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3。实时荧光定量PCR、Western blotting法检测处理后细胞中E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达情况。MTT法检测PJ34、U0126在SKOV-3细胞增殖中的作用、Transwell侵袭实验检测PJ34、U0126在SKOV-3细胞迁移中的作用。实验结果:PJ34、U0126明显抑制卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3的生长增殖,且PJ34联合U0126的作用效果较单用PJ34明显。PJ34、U0126可提高SKOV-3细胞中E-cadherin的表达,vimentin则反之,从而进一步抑制卵巢癌耐药细胞EMT的进展。U0126可增强PJ34对SKOV-3细胞生长侵袭的抑制作用。实验结论:1.PARP-1和ERK1/2联合通过EMT途径影响卵巢癌耐药细胞的生物学行为。2.PARP-1抑制剂和ERK1/2抑制剂可作为卵巢癌术后愈后的临床数据分析。3.PARP-1抑制剂和ERK1/2抑制剂的低毒性、高特异性的剂量还需进一步研究。4.PARP-1抑制剂联合ERK1/2抑制剂可作为卵巢癌靶向治疗的新靶点。第二部分PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮细胞SKOV-3中的表达及意义实验目的:通过检测PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮细胞SKOV-3,卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3中的mRNA的水平和蛋白表达情况,探索卵巢癌顺铂耐药与PARP-1及EMT的相关性。实验方法:实时荧光定量PCR、Western Blotting法检测卵巢癌上皮细胞,卵巢癌顺铂耐药细胞中PARP-1、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达情况。实验结果:PARP-1、vimentin在卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3阳性表达率高于卵巢癌上皮细胞SKOV-3,而E-cadherin则相反,差异均具有统计学显著性(P0.05)。E-cadherin表达与PARP-1表达呈负相关(P0.05),vimentin表达与PARP-1表达呈正相关(P0.05)。实验结论:1.PARP-1,EMT可影响卵巢癌细胞对铂类药物的化疗耐药。2.PARP-1可通过影响EMT中的E-cadherin和vimentin的表达进而影响卵巢癌细胞对顺铂药物的化疗耐药。3.是否还有其他因子与PARP-1共同影响E-cadherin和vimentin的表达,有待于进一步研究。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

【参考文献】