基于ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药的作用及机制

发布时间：2018-03-10 21:46

  本文选题：自噬通量　切入点：ATP　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在卵巢癌的治疗中,顺铂类化疗药物仍是其一线药物,并取得了一些治疗效果。随着顺铂在卵巢癌治疗中的广泛应用,发现卵巢癌细胞逐渐对其产生耐受,这也是临床卵巢癌治疗的难点。顺铂主要是作用于细胞内的DNA,导致DNA损伤,进而导致细胞周期停滞和凋亡。文献报道,内质网应激、自噬等细胞适应性反应可能参与了卵巢癌等肿瘤的顺铂耐受。自噬能隔离细胞质中的成分,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解细胞内损伤的细胞器及堆积的蛋白质,为细胞代谢提供物质。在正常的生理或者药物刺激条件下,自噬保护肿瘤细胞免于化疗药物诱导的细胞凋亡。也有研究表明,过度或者持续的自噬导致肿瘤细胞死亡。自噬在肿瘤细胞中可能发挥双重作用,但其准确的作用机制仍然存在争议。自噬是溶酶体依赖的过程,并且在自噬末端需要与溶酶体融合形成自噬溶酶体,保障自噬通量顺利进行,同时自噬体与溶酶体的融合需要消耗大量溶酶体。随着研究的深入,发现自噬可能参与了肿瘤细胞化疗药物如顺铂的耐受。而溶酶体功能与数量的维持对自噬通量是至关重要的,因此我们推测自噬-溶酶体可能与肿瘤细胞的化疗药物耐受有关。研究发现在溶酶体内含有丰富的ATP,由于溶酶体也是细胞的降解中心,其腔内较低的p H环境和水解酶对溶酶体的降解功能至关重要,而ATP可为溶酶体内酸性环境和其内水解酶活性提供所需的能量。具有较低p H的溶酶体腔是溶酶体内水解酶活化的最佳环境,V-ATP酶对溶酶体酸性环境的维持具有重要作用,而V-ATP酶蛋白质复合物功能的维持需要ATP提供能量。溶酶体内部分水解酶的高表达也与肿瘤有关,尤其是恶性肿瘤中常高表达Cathepsin D;若其缺陷可诱导细胞死亡;而Cathepsin D在溶酶体内发挥活性需要ATP为其提供能量。溶酶体功能受损时,降低自噬溶酶体的功能,甚至影响自噬溶酶体融合,严重时溶酶体内的水解酶可被释放至细胞质中,触发细胞凋亡。我们推测减少溶酶体内ATP可能会导致溶酶体功能受损,降低自噬溶酶体功能,影响自噬通量,因而溶酶体内ATP可能是调控肿瘤细胞化疗药物耐受的重要决定因素。本研究以人卵巢癌细胞SKOV3细胞(亲代)和SKOV3/DDP细胞(顺铂耐受)为研究对象,基于ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药的作用及机制,为肿瘤化疗药物耐受的治疗提供新的策略。方法:⑵MTT法检测顺铂对人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞存活率的影响。⑵顺铂处理人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞后,通过Western blot检测Cleaved Caspase-3,p62,LC3,LAMP1,Cathepsin D表达;间接免疫荧光方法观察p62与LC3或Ub的共定位。⑶利用激光共聚焦显维镜观察SKOV3和SKOV3/DDP细胞中LTR着色的变化,和LAMP1与LC3共定位。⑷利用Cathepsin D活性试剂盒,检测SKOV3和SKOV3/DDP细胞中Cathepsin D活性的改变。⑸利用自噬抑制剂3-MA或CQ,抑制自噬后,MTT法检测SKOV3/DDP细胞存活率的变化;通过Western blot检测p62,LC3,Ub,Bcl-2,Bax,Cleaved Caspase-3,Cathepsin D和t Bid的表达;激光共聚焦显维镜观察LAMP1与LC3共定位,LTR着色的变化;Cathepsin D活性试剂盒检测Cathepsin D活性的改变;流式细胞术测量细胞凋亡率。⑹Cathepsin D活性抑制剂Pep A抑制Cathepsin D活性后,Western blot检测p62,LC3和Ub的表达;Cathepsin D活性试剂盒检测Cathepsin D活性变化;间接免疫荧光的方法检测LAMP1与LC3共定位。⑺利用激光共聚焦显微镜,通过Quinacrine染色检测细胞中溶酶体内ATP;利用DIDS抑制溶酶体内ATP聚集,通过激光共聚焦显微镜观察LTR染色的变化;Western blot检测p62和LC3表达;间接免疫荧光的方法检测LAMP1与LC3共定位。结果1.与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞对顺铂相对不敏感;顺铂可以诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞LC3-II表达增加;与SKOV3细胞相比,顺铂作用SKOV3/DDP细胞12h时,LC3-II蛋白表达较高,同时间接免疫荧光也观察到大量点聚集的p62和LC3共定位,提示顺铂可以诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞发生自噬,相比SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中自噬水平较高。2.与SKOV3细胞相比,在SKOV3/DDP细胞中,无论有无顺铂处理,溶酶体膜标志蛋白LAMP1及溶酶体内Cathepsin D表达较高;且顺铂诱导SKOV3/DDP细胞溶酶体内LTR着色增强,Cathepsin D活性增高。3.与自噬抑制剂3-MA和顺铂联合应用相比,靶向溶酶体的自噬抑制剂CQ与顺铂的联合应用更加明显地减少SKOV3/DDP细胞的存活率,引起LC3-II,p62和泛素化蛋白表达增加,减弱细胞内LTR着色,降低Cathepsin D活性,甚至发生线粒体途径凋亡。4.在SKOV3/DDP细胞中,Cathepsin D活性抑制剂Pep A和顺铂的联合,明显地降低了Cathepsin D活性,减弱LTR着色,同时也上调了p62,LC3-II和泛素化蛋白的表达水平。5.相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中含有更加丰富的ATP;DIDS抑制SKOV3/DDP细胞的溶酶体内ATP聚集后,明显地减少了细胞中溶酶体内ATP的含量,同时上调了p62和LC3-II蛋白的表达,增加了LAMP1和LC3的共定位,减弱了LTR着色,降低Cathepsin D活性。结论:1.顺铂能够诱导卵巢癌细胞发生自噬,相对于SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中自噬水平较高;与SKOV3细胞相比,在SKOV3/DDP细胞中,无论有无顺铂处理,溶酶体膜标志蛋白LAMP1及溶酶体内Cathepsin D表达较高;顺铂诱导SKOV3/DDP细胞溶酶体内LTR着色增强和Cathepsin D活性升高,说明相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞内含有较丰富的溶酶体和Cathepsin D,这些结果提示自噬-溶酶体途径可能与卵巢癌细胞的顺铂耐受有关。2.靶向溶酶体的自噬抑制剂CQ与顺铂的联合应用比早期阶段自噬抑制剂3-MA和顺铂联合应用,更加明显地减少SKOV3/DDP细胞的存活率,增加p62,LC3-II和泛素化蛋白的表达,减弱LTR着色和降低Cathepsin D活性,引起自噬溶酶体的蓄积,甚至触发线粒体途径凋亡,说明通过干扰溶酶体功能而抑制自噬通量增加了SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,提示自噬保护卵巢癌细胞免于顺铂诱导的凋亡,而且溶酶体可能通过调控自噬通量参与卵巢癌的顺铂耐受。3.相对SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞中含有较丰富的Cathepsin D;抑制溶酶体内Cathepsin D的活性,可增加自噬相关蛋白p62,LC3-II的表达,降低溶酶体内LTR着色和Cathepsin D活性,提示溶酶体内Cathepsin D可能通过维护溶酶体的降解功能保障自噬通量,参与卵巢癌的顺铂耐受。4.对比SKOV3细胞,SKOV3/DDP细胞的溶酶体内含有较丰富的ATP,DIDS抑制SKOV3/DDP细胞的溶酶体内ATP聚集,明显地增加了自噬相关蛋白的表达,降低溶酶体内LTR着色和Cathepsin D活性,甚至引起自噬溶酶体蓄积,提示减少溶酶体内ATP不仅影响溶酶体,也可能干扰自噬溶酶体的降解功能,进而调控自噬通量参与卵巢癌细胞的顺铂耐受。本实验首次通过ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药中的作用及机制,为克服肿瘤细胞化疗药物耐受提供新的策略。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 马敏;;ATP治疗阵发性室上性心动过速的临床分析[J];中外医学研究;2011年27期

2 赵令时;王善言;;对ATP转复室上性阵发性心动过速的实用价值初步探讨(附21例分析及文献复习)[J];昌潍医学院学报;1986年02期

3 常唐喜;ATP治疗阵发性室上性心动过速14例分析[J];江苏医药;1994年10期

4 常唐喜;ATP治疗阵发性室上性心动过速14例分析[J];南京医科大学学报;1995年02期

5 周爱华;小剂量ATP治疗婴幼儿室上性阵发性心动过速12例[J];衡阳医学院学报;1998年02期

6 张敏秀,邵力,陈立志;ATP治疗阵发性室上性心动过速10例[J];黑龙江医学;1999年11期

7 刘荣先;ATP治疗小儿阵发性室上性心动过速20例疗效观察[J];河南诊断与治疗杂志;2000年04期

8 朱恒青,罗学坚;小剂量ATP转复老年阵发性室上性心动过速[J];华北煤炭医学院学报;2000年02期

9 黎雪玲;ATP治疗阵发性室上性心动过速12例分析[J];华夏医学;2001年06期

10 肖志华;ATP终止阵发性室上性心动过速的临床应用[J];河北医药;2001年05期

相关会议论文 前10条

1 胡世超;唐伟;王华明;赵艳;李娜;刘锋;;再生型表面等离子体共振生物传感平台构建及凝血酶、ATP和H~+分析[A];中国化学会第29届学术年会摘要集——第04分会：纳米生物传感新方法[C];2014年

2 李凡;李树清;张颖;李霞;陈静;龚敏;冯蕊;;ATP与新生大鼠缺氧后阿米巴样小胶质细胞活化的相关机制研究[A];第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2009年

3 王虎;陈亚强;;三磷酸腺苷(ATP)治疗17例阵发性室上性心动过速体会[A];中华医学会急诊医学分会第十三次全国急诊医学学术年会大会论文集[C];2010年

4 谢璐璐;孙秀兰;梁睿;范益;丁建花;胡刚;;不同亚基构成的K_(ATP)通道在缺血性脑损伤中的作用[A];中国药理学会第十次全国学术会议专刊[C];2009年

5 龚大江;刘家家;李春斌;彭年才;李明;张镇西;;手持式ATP荧光检测仪的研制[A];中国生物医学工程进展——2007中国生物医学工程联合学术年会论文集（上册）[C];2007年

6 王波;;灸法对肾阳虚模型大鼠ATP能量代谢的影响[A];2011中国针灸学会年会论文集（摘要）[C];2011年

7 李妍;栾洋;任进;;大黄素通过抑制ATP与拓扑异构酶Ⅱ的结合导致DNA产生双链断裂[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

8 李妍;栾洋;任进;;大黄素通过抑制ATP与拓扑异构酶II的结合导致DNA产生双链断裂[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年

9 王波;;灸法对肾阳虚模型大鼠ATP能量代谢的影响[A];中国针灸学会针灸器材专业委员会第十四届学术研讨会参会代表手册[C];2011年

10 邱伟强;陈刚;陈舜胜;谢晶;;离子对HPLC法同时测水产品中6种ATP关联产物的研究[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年

相关重要报纸文章 前5条

1 记者 谢雪琳;地铁司机：ATP系统为何没起作用[N];第一财经日报;2011年

2 张耀光;中网ATP赛事也可能升级[N];中国体育报;2007年

3 早报记者 朱轶;ATP总裁：上海会培养中国的天才[N];东方早报;2012年

4 朱学鹏 丁 丹;ATP治疗急性脑梗塞临床观察[N];中国中医药报;2004年

5 主任医师 容小翔;心率过缓者忌用ATP[N];大众卫生报;2006年

相关博士学位论文 前9条

1 冯吉锋;嘌呤能信号在神经系统中的作用[D];第二军医大学;2015年

2 马丽伟;基于ATP调控溶酶体探讨自噬通量在卵巢癌顺铂耐药的作用及机制[D];吉林大学;2016年

3 陈峰;高糖对脑微血管内皮细胞抗氧化系统和ATP水平的影响及白藜芦醇的干预机制研究[D];第二军医大学;2010年

4 朱煜明;新型K_（ATP）开放剂埃他卡林对人肺动脉收缩与肺动脉平滑肌细胞增殖的影响[D];南京医科大学;2008年

5 张登文;雌激素对可兴奋性细胞K_(ATP)通道的调节及意义[D];华中科技大学;2013年

6 杨明夏;K_（ATP）通道开放剂Iptakalim抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖的蛋白质组学研究[D];南京医科大学;2009年

7 史策;鲢鱼尸僵及贮藏过程中ATP关联物及生化特性变化规律的研究[D];中国农业大学;2015年

8 林茹;ATP敏感钾离子通道开放剂对缺血心肌的保护作用[D];浙江大学;2002年

9 黄朝辉;苯并硫氮杂（艹卓）类GSK 3β非ATP竞争抑制剂的设计、合成和构效关系研究[D];复旦大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 朱吉敏;城市轨道交通ATP的研究与仿真[D];西南交通大学;2015年

2 王丽;大肠杆菌O157:H7在土壤矿物表面吸附的ATR-FTIR和ATP研究[D];华中农业大学;2015年

3 王照宇;非洲爪蟾卵母细胞ATP-激活电流特征及其调制[D];武汉科技大学;2006年

4 倪布清;新型K_（ATP）通道开放剂埃他卡林对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响[D];南京医科大学;2007年

5 韦闯;ATP优秀选手三种场地类型发球特征与效果研究[D];沈阳师范大学;2014年

6 李德辉;自由空间激光通信系统ATP粗跟踪单元研究[D];长春理工大学;2007年

7 何艳;ATP生物发光法中ATP提取剂的研究[D];华东师范大学;2007年

8 冯峥;基于通信的列车自动防护系统（ATP）关键技术研究[D];中南大学;2013年

9 朱超;干旱条件下硫营养对玉米硫酸盐转运蛋白和ATP硫酸化酶基因表达的影响[D];西北农林科技大学;2007年

10 桑春花;细胞外ATP对拟南芥花粉萌发的影响及其信号转导初探[D];河北师范大学;2009年

，

本文编号：1595201