Ras相关Aurora kinases和Stanniocalcin 2在卵巢癌发生和进展中的作用及机理研究

发布时间：2018-03-24 10:28

  本文选题：极光激酶A/B　切入点：乳腺癌易感蛋白1/2　出处：《复旦大学》2014年博士论文

【摘要】：卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,卵巢恶性上皮性肿瘤死亡率居首,严重威胁着全球女性的健康。Ras是肿瘤中最常见的癌基因,70%以上的卵巢癌中可检测到Ras蛋白过度表达。Ras可以激活许多下游信号通路,其中包括Aurora kinases家族和Stanniocalcin家族。第一部分Ras相关Aurora kinases和基因组不稳定性相关肿瘤发生的机理研究背景极光激酶(Aurora kinases)是一个丝/苏氨酸蛋白激酶家族,位于Ras信号通路下游,与细胞有丝分裂相关,且在多种肿瘤中有高表达,是一种重要的癌基因。卵巢癌和胰腺癌中常同时存在极光激酶A/B (Aurora kinase A/B, AurA /B)的激活或乳腺癌易感蛋白1/2 (Breast cancer susceptibility protein 1/2, BRCA1/2)的失活。AurA/B和BRCA1/2之间的不平衡可能影响肿瘤细胞的增殖和肿瘤的发生,但是,这些分子之间的相互作用和调控肿瘤发生的机制仍不清楚。目的研究AurA/B和BRCA1/2之间的相互调节对肿瘤发生的影响,为优化AurA/B和BRCA1/2相关肿瘤的诊断和治疗提供指导。方法卵巢癌细胞株OVCA433和在胰腺癌细胞株Capan-1中,用特定shRNA单独或联合沉默AurA/B或／和BRCA1/2,检测所获细胞株中AurA/B 和BRCA1/2蛋白和mRNA的水平,并研究这些细胞的增殖能力、平板克隆形成能力、细胞周期分布及相关蛋白的表达、胞质分裂、细胞多核性、染色体四倍体性和裸鼠成瘤能力。结果在卵巢癌细胞系OVCA433中,AurA沉默增加BRCA1/2的表达,但对AurB的表达影响不明显；干扰AurB的表达促进AurA和BRCA1/2的表达,同时沉默BRCA1/2明显提高AurA的表达而不影响AurB。在BRCA2基因功能缺陷的胰腺癌细胞株C apan-1中,AurA和AurB的蛋白表达相互补充,AurA和AurB沉默后BRCA1的表达上调,BRCA1沉默后AurA降低,AurB变化不明显。在这两株细胞中,同时沉默AurA和AurB明显提高BRCA1/2的表达。单独或联合干扰AurA/B口/或BRCA1/2对其他基因的mRNA水平没有影响。用MG132处理细胞后,AurA/B和BRCA1/2蛋白之间的相互影响消失。干扰AurA和／或AurB的表达抑制细胞增殖、减少平板克隆形成数、抑制细胞周期进程,而干扰BRCA1和／或BRCA2促进细胞增殖、增加平板克隆形成数、促进细胞周期进程,同时干扰AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2对细胞增殖、平板克隆形成能力和细胞周期的影响。沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白变化,其中比较一致的是p53和cyclin A。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表达、减少cyclin A的表达,而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclin A水平,同时沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/B或BRCA1/2对p53和cyclin A的影响。相比于对照组,低表达AurA和/或AurB的细胞系细胞多核性和染色体四倍体性降低,而低表达BRCA1和/或BRCA2细胞多核性和染色体四倍体性提高,AurA/B和BRCA1/2同时低表达的细胞系中细胞多核性和染色体四倍体性与对照组细胞相当。在有丝分裂末期,两种细胞中AurA/B和BRCA1/2均同时定位于中间体,但Capan-1细胞中BRCA1在中间体的累积不明显。沉默AurA和/或AurB增加BRCA2在中间体上的表达,对BRCA1影响不明显,沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中间体的累积。在裸鼠成瘤实验中,相比于对照组,低表达AurA和/或AurB的细胞系肿瘤生长慢,而低表达BRCA1和/或BRCA2的细胞系肿瘤生长快,同时低表达AurA/B和BRCA1/2的细胞系肿瘤生长快于AurA和/或AurB干扰组,而慢于BRCA1和/或BRCA2干扰组。结论AurA/B和BRCA1/2之间相互负性调节,并反相影响细胞增殖、细胞周期进程、胞质分裂、细胞多核性、四倍体性和肿瘤的发生。干扰AurA和／或AurB的表达抑制细胞增殖、减少平板克隆形成数、抑制细胞周期进程,而干扰BRCA1和／或BRCA2促进细胞增殖、增加平板克隆形成数、促进细胞周期进程,同时干扰AurA/B和BRCA1/2抵消AurA/B或BRCA1/2对细胞增殖、平板克隆形成能力和细胞周期的影响。沉默AurA/B和/或BRCA1/2引起一系列周期蛋白变化,其中比较一致的是p53和cyclin A。沉默AurA和/或AurB增加p53蛋白的表达、减少cyclin A的表达,而沉默BRCA1和/或BRCA2降低p53水平、增加cyclin A水平,同时沉默AurA/B和BRCA1/2中和AurA/B或BRCA1/2对p53和cyclin A的影响。相比于对照组,低表达AurA和/或AurB的细胞系细胞多核性和染色体四倍体性降低,而低表达BRCA1和/或BRCA2细胞多核性和染色体四倍体性提高,AurA/B和BRCA1/2同时低表达的细胞系中细胞多核性和染色体四倍体性与对照组细胞相当。在有丝分裂末期,两种细胞中AurA/B和BRCA1/2均同时定位于中间体,但Capan-1细胞中BRCA1在中间体的累积不明显。沉默AurA和/或AurB增加BRCA2在中间体上的表达,对BRCA1影响不明显,沉默BRCA1和/或BRCA2增加AurA/B在中间体的累积。在裸鼠成瘤实验中,相比于对照组,低表达AurA和/或AurB的细胞系肿瘤生长慢,而低表达BRCA1和/或BRCA2的细胞系肿瘤生长快,同时低表达AurA/B和BRCA1/2的细胞系肿瘤生长快于AurA和/或AurB干扰组,而慢于BRCA1和/或BRCA2干扰组。结论AurA/B和BRCA1/2之间相互负性调节,并反相影响细胞增殖、细胞周期进程、胞质分裂、细胞多核性、四倍体性和肿瘤的发生。第二部分Ras下游Stanniocalcin2在卵巢癌的发生、发展中的作用及机理背景分泌型蛋白斯钙素(Stannbcalcin, STC)在鱼类中参与调节钙磷平衡。人类STC包含STC1和STC2两个成员,均和多种肿瘤有关。RAS转化的卵巢癌细胞中STC1水平升高,并促进肿瘤的发生,但STC2在卵巢癌中的作用还不清楚。目的研究STC2在卵巢癌发生中的作用及机制,为卵巢癌的诊断及治疗提供思路。方法首先在卵巢癌细胞系SKOV3中转染HA-tag标记的STC2 cDNA,以证明分泌型蛋白STC2可以作用于自身细胞；然后在一系列卵巢癌细胞系中用STC2shRNA或cDNA沉默或过表达STC2,以系统研究STC2对卵巢癌细胞增殖、平板克隆、周期进程、对顺铂和紫杉醇的敏感性及细胞迁移和侵袭能力的影响；并构建动物模型,以观察STC2在体内的作用；最后构建人高级别浆液性卵巢癌和正常卵巢的组织芯片,分析STC2与患者生存期的关系。结果STC2可以分泌至细胞外,再从胞外结合到细胞膜上。在Hey、Hey A8、 OVCA420、OVCA429细胞中,干扰STC2的表达抑制细胞增殖和平板克隆形成、促进G1-S周期阻滞、促进细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,促进细胞迁移和侵袭；相反,在A2780、SKOV3、SKOV3 ip1细胞中,过表达STC2促进细胞增殖和平板克隆形成、促进G1-S周期过渡、抑制顺铂和紫杉醇引起的凋亡,抑制细胞迁移和侵袭。低表达STC2的细胞中细胞周期相关蛋白CDK2、CDK4、CDK6表达较对照组低,而促凋亡蛋白Bax、Bid和cytoC表达较高；抑存活并促转移蛋白p38、pp38表达升高,STAT3表达升高或不变,pSTAT表达下调；MEK、ERK1、 pERK1/2蛋白的表达没有明显变化；过表达STC2的细胞中以上蛋白变化趋势相反。在裸鼠皮下移植瘤实验中,干扰Hey细胞中的STC2抑制肿瘤生长,过表达SKOV3 ip1细胞中的STC2促进肿瘤生长；在裸鼠腹腔种植转移模型中,低表达STC2促进腹腔种植转移,而过表达STC2抑制腹腔转移灶的形成。STC2在卵巢癌组织中高表达,而在正常卵巢组织中几乎不表达。高表达STC2的患者有更长的无进展生存期和总生存期。结论STC2促进卵巢癌细胞增殖和耐药并促进肿瘤生长,但抑制细胞迁移侵袭并抑制腹腔种植转移,STC2高表达可能和卵巢癌患者较好的预后相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

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本文编号：1657901