沉默SMG-1基因对低氧卵巢癌SKOV3细胞株凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2018-04-05 00:00

本文选题：生殖器形成抑制基因-1　切入点：凋亡　出处：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：卵巢癌是常见的一种妇科恶性肿瘤,有着很高的死亡率,目前对该病的治疗主要是手术加化疗,而化疗耐药使得该病治疗效果并不乐观。如今针对卵巢癌的研究虽然已经有了很大的发展,但卵巢癌具体的发病机制仍不清楚,这给卵巢癌的防治工作带来了极大的困难。作为一种实体性肿瘤,卵巢癌内部存在着一定程度的缺氧,缺氧微环境对肿瘤的发生发展有着重要的影响,这种影响在肿瘤细胞的凋亡、侵袭、迁移等一系列生物学行为上都已有研究。因此以缺氧的卵巢癌细胞为研究对象对卵巢癌相关生物学行为进行研究更能贴近肿瘤细胞在体内的真实情况,具有不可忽视的重要意义。生殖器形成抑制基因-1(suppressor of morphogenesis in genitalia-1,SMG-1)是在无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径中被广泛研究的重要调节因子,该途径可降解包含过早终止密码子的mRNA来防止具有潜在毒性的截短蛋白的产生。SMG-1同时也是磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)家族成员之一,同其他PIKK蛋白激酶一样,SMG-1在DNA损伤应激反应中发挥作用,从而维持基因组的稳定性。除此之外SMG-1还参与到氧化应激反应、缺氧、细胞增殖及凋亡等多个生物进程中,甚至可以调控肿瘤的生长,目前已有多项研究将其引入肿瘤领域。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是一种重要的核转录因子,在很多人类肿瘤中可被持续性激活,形成p-STAT3,p-STAT3可形成二聚体,从细胞质转移至细胞核,从而对一系列的基因表达进行调控,发挥生物学功能。STAT3是许多致癌相关信号通路的汇聚点,可控制若干促炎性细胞因子和生长因子的细胞内信号转导通路。在人卵巢癌细胞中可发现异常激活的STAT3,该异常活化状态的STAT3可对卵巢癌细胞的增殖及凋亡产生影响。目的本研究采用qRT-PCR、Western blot的方法检测缺氧状态下的卵巢癌细胞中SMG-1的表达情况及抑制该基因后STAT3的表达及活化情况,用流式细胞术和CCK-8检测抑制SMG-1基因后对缺氧卵巢癌细胞凋亡、增殖情况的影响,来探究缺氧条件下SMG-1的表达以及沉默SMG-1基因对缺氧状态卵巢癌细胞凋亡和STAT3、p-STAT3表达的影响。材料和方法1研究对象本研究选用人卵巢癌SKOV3细胞系(购自American Type Culture Collection),在37℃、5%CO_2饱和湿度的恒温培养箱中,用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)进行培养。2方法本研究使用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)培养SKOV3细胞,待细胞对数生长期时开始种板进行后续试验。2.1缺氧实验分组及处理将对数生长期的SKOV3细胞经0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接种于六孔板中,细胞长满50%-60%时开始缺氧处理。细胞分为常氧组和缺氧组。缺氧组加入氯化钴(终浓度150μmol/L),常氧组不作处理。48h后分别提取总mRNA和总蛋白,首先通过Western blot方法对缺氧效果进行验证,缺氧后HIF-1α蛋白表达量与未缺氧组细胞相比明显升高(P0.05)为缺氧成功。然后采用qRT-PCR和Western blot方法对两组细胞进行SMG-1 mRNA和蛋白表达水平的检测。2.2转染实验分组及处理将对数生长期的SKOV3细胞经0.25%胰酶消化后以1.0×105密度接种于六孔板中,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基进行培养,待细胞贴壁后加入氯化钴(终浓度150μmol/L)进行缺氧,缺氧24h后进行转染,转染参照Lipofectamine2000说明书进行。转染实验分为四组。A组为空白对照,不加siRNA和Lipofectamine2000;B组加入阴性对照siRNA和转染试剂Lipofectamine2000;C组加入转染试剂Lipofectamine2000;D组加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。转染6h后更换完全培养基(含10%胎牛血清及150μmol/L氯化钴),恒温箱继续培养48h后经qRT-PCR和Western blot方法分别在mRNA和蛋白水平对SMG-1 siRNA沉默效果进行验证,D组SMG-1表达量与A、B、C组相比有显著性差异(P0.05)且D组与A组相比SMG-1表达抑制率大于50%可判定SMG-1基因被有效沉默。之后对A、B、C、D四组细胞分别进行凋亡率检测(采用流式细胞术)和增殖抑制率检测(采用CCK-8的方法),并提取总RNA和总蛋白,采用qRT-PCR和Western blot实验分别检测四组细胞中STAT3 mRNA相对表达水平和STAT3、p-STAT3蛋白表达水平。3统计学处理本研究采用SPSS21.0软件对所得到的实验数据进行统计学分析,计量资料均以(?)±s来表示。两组数据之间的分析比较采用两独立样本t检验,多组数据之间的比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1缺氧处理后SKOV3细胞SMG-1mRNA和蛋白的表达1.1缺氧处理后SKOV3细胞SMG-1mRNA的相对表达水平缺氧组SKOV3细胞中SMG-1 mRNA相对表达水平为4.19±0.94,常氧组SMG-1 mRNA相对表达水平为1.12±0.17,缺氧组与常氧组相比SMG-1 mRNA表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。1.2缺氧处理后SKOV3细胞中SMG-1蛋白表达水平缺氧组SKOV3细胞中SMG-1蛋白表达水平为0.58±0.11,常氧组SMG-1蛋白表达水平为0.26±0.06,缺氧组与常氧组相比SMG-1蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。2缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞凋亡情况流式细胞术检测结果显示,A组细胞凋亡率为(5.7±1.22)%,B组细胞凋亡率为(6.6±0.87)%,C组细胞凋亡率为(6.9±1.35)%,D组细胞凋亡率为(10.2±0.70)%。D组细胞与A组、B组、C组相比凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。3缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞增殖情况CCK-8检测结果显示,A组作为参照,细胞增殖抑制率为0%。B组细胞增殖抑制率为(22.54±5.74)%、C组为(22.56±1.11)%、D组为(42.17±5.03)%,D组与B组、C组相比细胞增殖抑制率明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。4缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中SMG-1和STAT3 mRNA的表达4.1缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中SMG-1 mRNA的表达荧光定量PCR结果显示,SKOV3细胞中SMG-1 mRNA的表达水平A组为1.00±0.07,B组为1.02±0.13,C组为0.88±0.07,D组为0.46±0.04。D组细胞中SMG-1 mRNA的表达水平与A组、B组和C组相比明显降低,经统计学处理分析差异具有统计学意义(P0.05)。4.2缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中STAT3 mRNA的表达荧光定量PCR结果显示,SKOV3细胞中STAT3 mRNA的表达水平A组为1.00±0.05,B组为0.98±0.10,C组为0.86±0.04,D组为0.68±0.08。D组细胞中STAT3 mRNA的表达水平与A组、B组和C组相比明显降低,经统计学处理分析差异具有统计学意义(P0.05)。5缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中SMG-1、STAT3和p-STAT3蛋白的表达5.1缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中SMG-1蛋白的表达Western blot结果显示,SKOV3细胞中SMG-1蛋白表达水平A组为0.38±0.06,B组为0.37±0.06,C组为0.38±0.03,D组为0.16±0.04。D组细胞中SMG-1蛋白表达水平与A组、B组和C组相比明显降低,经统计学处理分析差异具有统计学意义(P0.05)。5.2缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中STAT3蛋白的表达Western blot结果显示,SKOV3细胞中STAT3蛋白表达水平A组为0.59±0.05,B组为0.63±0.05,C组为0.71±0.05,D组为0.46±0.03。D组细胞中STAT3蛋白表达水平与A组、B组和C组相比明显降低,经统计学处理分析差异具有统计学意义(P0.05)。5.3缺氧状态下抑制SMG-1后SKOV3细胞中p-STAT3蛋白的表达Western blot结果显示,SKOV3细胞中p-STAT3蛋白表达水平A组为0.56±0.03,B组为0.62±0.04,C组为0.61±0.04,D组为0.34±0.02。D组细胞中p-STAT3蛋白表达水平与A组、B组和C组相比明显降低,经统计学处理分析差异具有统计学意义(P0.05)。结论缺氧可影响SMG-1表达水平;抑制SMG-1可影响STAT3的表达及活化,从而共同参与低氧SKOV3细胞凋亡进程。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

【参考文献】