人羊水干细胞预防和逆转顺铂所致卵巢损伤的实验研究

发布时间：2018-04-10 02:32

  本文选题：人羊水干细胞　切入点：卵巢早衰　出处：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景:每年全世界有上百万女性被诊断为癌症,其中约10%的患者在育龄期,化学治疗的不断发展与支持性治疗的不断进步使癌症患者的生存率显著提高,约90%早期诊断的年轻女性患者可以存活,但是化学治疗所带来的远期并发症的风险却日益突出。其中,最主要的远期影响包括由卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)或者卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)导致的早期绝经和不育。对于年轻的妇科肿瘤患者,虽然接受了保留生育功能的手术,却因术后化学治疗对生殖系统的损害而仍然无法拥有生育能力,严重影响育龄患者的生存质量。随着癌症年轻化趋势的日益明显和年轻女性癌症患者存活率的提高,患者对有效的个性化生育保护措施的需求也随之增加。因此,在不影响癌症治疗的基础上,提高患者的生存质量、保护卵巢储备功能和预防不孕不育已经成为医生和患者共同面临的首要问题。临床研究和动物实验表明,在恶性肿瘤的化学治疗过程中,化疗药物可导致卵巢组织结构紊乱,影响卵泡的启动、生长和成熟过程,不同的化疗药物对卵巢的损伤途径和严重程度不同,但具体机制尚不明确。目前,临床上预防或治疗化疗所致卵巢早衰的方法主要包括:促性腺激素释放激素治疗,激素替代治疗,生育能力冷冻保存技术。但是每种方法都有各自的局限性,尚不能广泛应用于临床。随着再生医学的发展,干细胞已经应用于临床多种疾病的治疗,其在组织修复与再生中发挥重要作用。目前,已有研究表明,干细胞移植具有修复卵巢结构、改善卵巢功能和提高生育能力的作用,但作用机制尚不明确。近年来,人羊水干细胞(human amniotic fluid stem cells,h AFSc)的发现和研究为干细胞的应用开辟了新的研究领域。由于羊水来源广泛、获取简便、创伤小、免疫原性低、增殖分化能力强、无伦理道德方面的限制,在医学领域中具有广泛应用前景,h AFSc有望成为保护和修复化疗所致卵巢损伤的新方法,为保留生育功能的年轻女性癌症幸存者带来希望。研究目的:研究h AFSc的生物学特性与应用安全性;建立稳定的顺铂所致大鼠卵巢损伤的动物模型和大鼠卵巢颗粒细胞损伤的体外模型,探究顺铂损伤卵巢的可能途径;研究h AFSc预防性保护和治疗性修复顺铂所致大鼠卵巢损伤的可行性及可能机制,以及h AFSc体外修复顺铂损伤的颗粒细胞的可行性及可能途径。为化疗所致卵巢损伤的预防和治疗提供理论基础,为临床上保护卵巢功能提供全新的思路和策略。实验方法:第1部分:h AFSc的分离、培养、鉴定与生物学特性分析1.通过产前诊断或自愿引产的途径采集人孕中期羊水标本,采用差异贴壁与机械分离的方法收集和纯化h AFSc;2.通过细胞形态学观察、流式细胞术检测细胞表面干细胞标志物的表达、MTT检测细胞增殖能力,对分离培养的h AFSc进行初步鉴定;3.通过MTT方法检测h AFSc冻存前后增殖能力、Western Blot方法检测不同代数h AFSc多能干细胞标志物Oct3/4、Nanog和Sox-2的表达、定向诱导h AFSc向脂肪细胞和骨细胞分化的方法,对h AFSc的生物学特性进行分析;4.通过给裸鼠皮下注射h AFSc的方法检测h AFSc的成瘤性,评估h AFSc在使用中的安全性。第2部分:顺铂诱导大鼠卵巢损伤模型的建立及损伤途径的研究将有正常动情周期的8周龄SD大鼠随机分为4组:对照组(0.9%生理盐水),低剂量顺铂给药组(1.0mg/kg)、中剂量顺铂给药组(1.5mg/kg)、高剂量顺铂给药组(2.0mg/kg)。造模前各组尾尖采血收集血样,连续腹腔注射顺铂6天,分别于第7天、第15天、第30天、第45天处死大鼠,获取血液样本、双侧卵巢和子宫。1.实验中观察大鼠一般状态,称量体重,绘制大鼠生存曲线;2.通过卵巢、子宫的大体观察、HE染色和卵泡计数,评估不同浓度顺铂对大鼠卵巢和子宫组织结构的损伤程度;3.通过Elisa方法检测大鼠血清FSH、E2水平,分析不同浓度顺铂对卵巢内分泌功能的影响;4.通过TUNEL法和Western Blot方法分别检测大鼠卵巢组织凋亡情况和FSHR蛋白的表达,用以探究顺铂对卵巢损伤的可能途径。第3部分:h AFSc预防和治疗顺铂所致大鼠卵巢损伤的体内实验选用PHK26荧光染料标记第3代h ASFc,分别用于h AFSc移植的治疗实验和预防实验。将有正常动情周期的8周龄SD大鼠纳入实验。h AFSc治疗卵巢损伤的研究中,大鼠随机分为3组,对照组(0.9%生理盐水)、模型组(1.5mg/kg顺铂连续注射6天)、治疗组(1.5mg/kg顺铂连续注射6天+h AFSc尾静脉移植),治疗组于连续注射6天顺铂后1天(第7天)尾静脉移植h AFSc。于顺铂使用第1天(造模前)、第7天、第30天尾尖采血,并分别于第15天、第45天处死大鼠,获取血样,剖取卵巢。1.实验过程中观察大鼠一般状态,卵巢组织冰冻切片观察PKH26标记的h AFSc在卵巢中的存活与分布;2.Elisa方法检测大鼠血清FSH、E2水平分析h AFSc移植对卵巢内分泌功能的影响;3.通过对卵巢的大体观察、HE染色和各级卵泡计数评估h AFSc预防和修复大鼠卵巢组织结构的效果;4.通过Western Blot方法检测PI3K/PTEN/Akt信号通路中PTEN、p-PTEN、Akt、p-Akt和信号通路下游分子FOXO3a、p-FOXO3a、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表达,探究h AFSc预防性移植在顺铂作用期间对卵巢原始卵泡的保护机制;5.通过Western Blot方法检测经典凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达,初步研究h AFSc移植对顺铂所致卵巢组织细胞凋亡的影响。h AFSc预防卵巢损伤的研究中,大鼠随机分为3组,对照组(0.9%生理盐水)、模型组(1.5mg/kg顺铂连续注射6天)、预防组(h AFSc尾静脉移植+1.5mg/kg顺铂连续注射6天),预防组于顺铂注射前2天尾静脉移植h AFSc。于干细胞移植前(即顺铂使用前2天)、顺铂使用第30天尾静脉采血,并分别于第7天、第15天、第45天处死大鼠,获取血样,剖取卵巢。实验方法同h AFSc治疗卵巢损伤的研究。第4部分:h AFSc修复顺铂所致大鼠卵巢颗粒细胞损伤的体外实验1.解剖显微镜下分离提取SD大鼠卵巢颗粒细胞,进行原代培养;2.通过细胞形态学观察、免疫荧光染色检测颗粒细胞FSHR的表达对提取的细胞进行鉴定,通过MTT方法检测颗粒细胞增殖活力,分析颗粒细胞的生长状态;3.通过MTT方法检测颗粒细胞增殖抑制率、结晶紫染色方法观察细胞形态变化、DAPI染色检测颗粒细胞凋亡的情况,综合分析不同浓度顺铂(0mg/L、1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)不同作用时间(24h、48h)对卵巢颗粒细胞生长和凋亡影响,选择合适的顺铂浓度和作用时间,建立顺铂所致大鼠卵巢颗粒细胞损伤的体外模型;4.通过Western Blot方法检测颗粒细胞FSHR蛋白的表达,探究顺铂对颗粒细胞FSHR蛋白表达的影响;5.通过Transwell小室(8μm孔径),将h AFSc与正常颗粒细胞或顺铂损伤的颗粒细胞共培养,检测h AFSc穿过聚碳酸酯膜的数量,分析h AFSc向受损颗粒细胞定向迁移的能力;6.选用Transwell小室(0.4μm孔径),将h AFSc与正常颗粒细胞或顺铂损伤的颗粒细胞共培养,通过TUNEL法检测颗粒细胞凋亡、Western Blot方法检测颗粒细胞FSHR蛋白表达,分析h AFSc修复受损颗粒细胞的能力和可能途径。实验结果:第1部分:1.分离纯化的h AFSc形态均一,成纤维样细胞呈旋涡状或放射状排列,并呈集落样生长;2.h AFSc表达多能干细胞的标志物Oct3/4、CD117、SSEA-4;表达间充质干细胞标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105;表达MHCI类分子HLA-ABC,不表达MHCII类分子HLA-DR;不表达造血干细胞标志物CD34、CD45;3.第15代h AFSc仍保持较高的增殖能力,不同代数h AFSc之间多能干细胞特异性蛋白Oct3/4、Nanog、Sox-2的表达无明显差异;4.h AFSc可向脂肪细胞、骨细胞分化;5.h AFSc不具有成瘤性。第2部分:1.各浓度顺铂均导致大鼠体重降低,高剂量顺铂组大鼠死亡率高;2.各浓度顺铂均可使大鼠血清FSH升高、E2降低。顺铂使用第45天时,中、高剂量组FSH仍保持较高水平,E2仍保持较低水平,而低剂量组在45天时FSH和E2水平已有明显恢复;3.中剂量顺铂可导致大鼠卵巢和子宫萎缩,影响卵巢各级卵泡数量。顺铂使用第7天时,卵巢中原始卵泡减少,窦前卵泡增多,窦状卵泡减少,闭锁卵泡增多;第30天时,闭锁卵泡增多,其它各级卵泡均显著减少,卵巢间质血管减少,纤维化严重;4.顺铂可导致生长卵泡中颗粒细胞凋亡,卵巢中FSHR蛋白表达减少。第3部分:1.PKH26标记的h AFSc可以向顺铂损伤的大鼠卵巢迁移并长时间存活;2.h AFSc预防性或治疗性移植,均可改善大鼠FSH、E2水平,预防性保护的效果优于顺铂损伤后的治疗效果;3.h AFSc预防性或治疗性移植对卵巢结构具有保护和修复作用,原始卵泡和各级生长卵泡数量较模型组显著增多,其中,预防性移植h AFSc对原始卵泡的保护效果最为明显,效果明显优于治疗性移植组;4.与对照组相比,顺铂可以显著增加PI3K/PTEN/Akt信号通路中关键蛋白的磷酸化与非磷酸化的比例,而预防性移植h AFSc,可以显著降低由顺铂导致的磷酸化与非磷酸化蛋白比例增高的作用;5.与对照组相比,顺铂可以上调Bax表达,下调Bcl-2表达,而治疗组和实验组Bax表达均较相应模型组显著降低,Bcl-2表达均较相应模型组显著升高。第4部分:1.原代大鼠卵巢颗粒细胞呈多角形、星形或梭形,高表达FSHR蛋白,细胞经过1-2天的潜伏期进入对数生长期,第6天开始进入平台期,第8天细胞开始退化;2.顺铂可以抑制颗粒细胞增殖,增加颗粒细胞凋亡,2.5mg/L浓度顺铂作用48h的颗粒细胞出现明显的凋亡改变:核固缩、核碎裂、核溶解,出现凋亡小体,造模后,细胞死亡率低,状态稳定;3.顺铂可以降低颗粒细胞FSHR蛋白的表达,1.25mg/L顺铂作用48h时对颗粒细胞增殖没有影响,但可以诱导颗粒细胞FSHR表达的减少;4.h AFSc可以向顺铂损伤的颗粒细胞定向迁移;5.h AFSc可以抑制顺铂所致的颗粒细胞凋亡,增加受损颗粒细胞FSHR蛋白的表达。结论:1.h AFSc增殖能力强且稳定,具有低免疫原性,不具有成瘤性,应用安全,在干细胞治疗中具有广泛的应用前景。2.1.5mg/kg浓度顺铂连续腹腔注射6天,可以建立稳定的顺铂所致大鼠卵巢损伤的动物模型,2.5mg/L浓度顺铂作用48h可以建立稳定的顺铂所致大鼠卵巢颗粒细胞损伤的体外模型。模型稳定可靠,可重复性高。3.顺铂对卵巢具有损伤作用,其损伤作用可能与促进原始卵泡的激活、促进颗粒细胞凋亡、降低FSHR蛋白表达有关。4.h AFSc移植可以预防性保护和治疗性修复顺铂损伤的卵巢结构和功能,预防性移植的效果优于损伤后移植的治疗效果,尤其对原始卵泡的保护作用显著。5.h AFSc预防性保护作用可能是通过抑制PI3K/PTEN/Akt信号通路的激活,从而减少顺铂对原始卵泡的激活作用、维持卵巢储备功能实现的。6.h AFSc治疗性修复作用可能是通过抑制卵巢颗粒细胞凋亡、增加FSHR蛋白表达,维持生长卵泡发育,从而间接抑制原始卵泡激活而实现的。
[Abstract]:鐮旂┒鑳屾櫙:姣忓勾鍏ㄤ笘鐣屾湁涓婄櫨涓囧コ鎬ц��璇婃柇涓虹檶鐥，

本文编号：1729291