维生素C调控滋养层干细胞分化和妊娠维持的效应及分子机制
发布时间：2018-04-11 05:21
本文选题：维生素C + 滋养层干细胞 ； 参考：《浙江大学》2015年博士论文
【摘要】：早在70年前已有文献报道,妊娠妇女若缺乏维生素C (vitamin C, VC)则容易出现自发性流产,而补充Vc能减少自发性流产的发生。这提示Vc在妊娠维持中可能扮演了重要的角色。本研究室近几年的研究表明,Vc能诱导人胎盘细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞株JEG-3、JAR产生甾体激素(E2和P4)和多肽激素(βhCG),但对Vc维持妊娠的具体分子机制尚不清楚。妊娠维持需要胎盘正常发育并行使其正常功能,胎盘的形成则需要其内部的滋养层干细胞(trophoblast stem cell, TSC)。TSC经各种转录因子调控,分化形成各种特异性的滋养层细胞。Vc是否通过调控TSC分化为各种特异性滋养层细胞的过程,进而影响胎盘的妊娠维持,尚未见报道。因此,深入研究Vc在TSC分化过程中的具体调控机制以及对胎盘妊娠维持的效应,对揭示Vc在妊娠维持中的作用具有重要的科学意义。本研究通过体外和体内试验发现,Vc能促进TSC分化以及妊娠维持的过程。1.在TSC分化的过程中,研究发现,Vc处理能诱导TSC分化时Ctsq、PL-Ⅱ、 SynA和Gcml的mRNA表达增高。Ctsq是迷路层窦状巨细胞(sinosoidal trophoblast giant cell, S-TGC)的特异性marker, SynA和Gcml是迷路层合胞体滋养层细胞的marker,上述结果提示Vc能促进TSC向迷路层细胞方向进行选择性分化,尤其是S-TGC方向的分化。TSC定向分化为S-TGC是由碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Hand1调控的。通过基因和蛋白质水平的检测,发现Vc能增高支配S-TGC分化的转录因子Hand1的蛋白水平,对mRNA水平则没有影响；核质分离实验显示,Vc同时增加TSC胞浆和胞核内Hand1的蛋白水平。为再次验证Vc能够调控Hand1蛋白的水平,通过Vc处理外源转染Flag标记的Hand1 (Flag-Hand1)人绒毛膜癌细胞JEG-3。Western blot和免疫荧光结果均表明,Vc可以剂量和时间依赖性提高Hand1的蛋白水平。已有研究发现,TSC向TGC分化是通过Hand1形成同源二聚体而发挥作用的。因此,我们通过免疫共沉淀实验证实,Hand1可以形成同源二聚体,Vc能增加Hand1总蛋白量,从而导致形成同源二聚体的Hand1数量增多,而对Hand1本身形成同源二聚体的能力并没有影响。上述结果揭示,Vc主要通过调控转录因子Hand1的蛋白表达水平,诱导TSC向S-TGC方向分化。2.Vc调控Hand1蛋白水平的具体机制。Western blot检测发现,不同浓度的Vc处理TSC细胞1 h,可剂量依赖性降低TSC细胞中的MAPK信号通路JNK和P38的磷酸化水平。为探究MAPK信号通路是否可能参与Vc诱导的S-TGC分化,我们在Vc诱导TSC分化的过程中,添加JNK和P38激动剂Anisomycin,观察其对Vc诱导TSC分化的影响。qPCR检测发现,Anisomycin能够剂量依赖性降低Vc诱导的S-TGC的Marker——Ctsq的mRNA水平。同时,Anisomycin能减少内、外源性Hand1的蛋白水平。相反,在TSC分化的过程中,通过JNK抑制剂SP600125和P38抑制剂SB203580分别处理TSC,以分别抑制JNK和P38信号通路,是否可以模拟Vc诱导的TSC分化?qPCR和Western blot检测发现,只有SP600125处理能剂量依赖性增高促进Ctsq mRNA的表达水平以及Flag-Hand1的蛋白表达水平,而SB203580没有相似的作用,提示Vc只通过JNK调控Hand1蛋白的水平。为进一步证实是JNK调控了Hand1,将构建的激活形式的JNK1 (JNK*)和Hand1共转染JEG-3细胞48 h, Western blot检测表明,JNK1*可减少Hand1蛋白的水平,而Vc处理并不改变JNK1激活所致Hand1蛋白水平的减少。与此结果相一致,通过慢病毒感染JNK1/2 shRNA特异性敲降JEG3中的JNK1/2水平,能增高Hand1蛋白的水平。上述结果揭示,Vc通过抑制TSC中JNK1的活性提高Hand1蛋白的水平。为进一步探究是否JNK1和Hand1有直接的作用,将JNK1*和Myc-Hand1共转染293T细胞,免疫共沉淀结果发现,JNK1*与Hand1蛋白有直接的结合。3.进一步探究JNK是如何调控Hand1蛋白的。之前的结果表明,JNK激动剂Anisomycin处理能降低Hand蛋白的水平,而JNK抑制剂SP600125处理能够增高Flag-Hand1的蛋白水平,提示是否JNK通过其激酶活性来调控Hand1蛋白的稳定性。因此,我们构建了持续失活突变的JNK1*(JNK*APF),将JNK1*APF和JNK1*分别与Hand1共转染JEG-3细胞。结果显示,JNK1确实是通过其激酶活性来调控Hand1蛋白的稳定性。为探究JNK激酶具体调控Hand1的哪一个或哪几个氨基酸位点,我们通过磷酸化预测软件GPS分析了Hand1蛋白中潜在的JNK磷酸化位点,并分别构建其失活突变体。JNK1*和各个Hand1突变体共转染JEG-3细胞48 h,Western blot检测发现,JNK1*不能减少p.S48A突变的Hand1,且使野生型Hand1和其他突变体蛋白位置上移的现象在p.S48A突变后消失。由此推测,第48位点的磷酸化会减弱Hand1蛋白的稳定性。为验证该假设,构建了模拟磷酸化形式的p.S48D突变的Hand1,Western blot和免疫荧光结果均表明,与野生型相比,p.S48A突变能够增加Hand1的蛋白含量,而p.S48D突变降低Hand1蛋白的含量。为证实JNK是否是通过磷酸化Hand1,进而使其发生降解而减少其蛋白的含量,我们用泛素化降解抑制剂MG132处理共转染JNK*和Hand1的JEG-3细胞。Western blot结果显示,MG132能够阻断JNK*磷酸化Hand1所导致的减少,表明JNK*磷酸化的Hand1可被泛素化体系识别并降解。与此结果相符,将Flag-Hand1和HA-Ubiqutin共转染293T细胞,免疫共沉淀检测发现,Vc处理能够减少连接结合在Hand1蛋白上的泛素的量。以上结果显示,JNK通过其激酶活性调控Hand1蛋白,使Hand1的第48位丝氨酸(serine)发生磷酸化,促进其泛素化降解。4.Vc对妊娠维持的影响。为揭示Vc对妊娠维持的影响,我们通过Talen技术构建特异性敲除C57小鼠Vc合成限速酶——L-古洛糖酸内酯氧化酶(L-Gulo),使其自身不能合成VC,以观察缺乏Vc对小鼠妊娠维持的影响。母鼠交配验到栓后,开始断Vc(E0.5 d),通过液相色谱对血清Vc含量进行检测,发现E8.5 d的Gulo-/-母鼠体内Vc水平很微弱或检测不到。取E18.5 d妊娠母鼠,发现缺乏Vc可促进胎鼠的吸收,正常存活的胎鼠重量明显低于Vc补充组。Western blot检测剩余存活胎盘中的Hand1蛋白,发现缺乏Vc组胎盘中的Hand1表达水平明显降低。在正常情况下,胎盘发育于E13.5 d已基本完成,而在缺乏Vc组未见到胎盘吸收情况发生,但通过对该妊娠天数的胎盘进行H-E检测,发现缺乏Vc使得胎盘迷路层结构间质结构增多,空隙增大。免疫组化检测CK(胎盘S-TGC的marker)和lamin(胎鼠血管marker),发现缺乏Vc可使S-TGC位置不均匀分布,胎鼠血管呈直线型,未出现正常情况下网络状交汇分布的现象,提示缺乏Vc可能影响Hand1的表达水平,以及迷路层S-TGC的形成和分布,进而使得母鼠-胎鼠血管交汇处获得的营养物质不能满足日益增大的胎鼠的需求,从而导致部分胎鼠出现体重下降、严重的即出现妊娠维持失败而表现为胎儿吸收状况。综上所述,本研究从细胞生物学的角度阐明了Vc主要通过抑制JNK信号通路上调Hand1转录因子的稳定性和蛋白水平,进而诱导TSC选择性分化为迷路层S-TGC过程中的具体调控。小鼠模型研究发现,缺乏Vc导致胎盘迷路层结构发生紊乱,间质结构增多,空隙增大。母体血管和胎鼠血管交汇不足,导致胎鼠营养获取不足、体重减轻,甚至妊娠维持失败。这可能是Vc不足或缺乏导致妊娠维持失败的主要原因。本研究有助于解释目前国际上对维生素包括Vc、VE等在体内补充问题引起的极大争论；同时,将为Vc新的生理学效应、Vc在妊娠中的重要角色、妊娠维持、胎儿发育的生理基础等提供新的视角。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714
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10 彭文;戴e，
本文编号：1734613
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