AGEs促进滋养细胞分泌sFlt-1及其机制探讨

发布时间：2018-04-22 04:18

本文选题：子痫前期(PE) + 可溶性血管内皮生长受体-1(sFlt-1)　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景：妊娠期高血压疾病是妊娠期特发的全身性疾病,据1988年我国25省流行病学调查发现发病率为9.4-10.4%。而子痫前期(preeclampsia, PE)是该疾病的常见类型,PE于妊娠20周以后发病,以高血压、水肿、蛋白尿为主要临床表现。PE不仅影响妊娠结局,也影响产妇及其后代的远期预后：与正常孕妇相比,PE患者日后发生心血管及脑血管疾病的几率增加约2倍,婴儿日后发生心脏病的风险也增加5倍。根据人民卫生出版社最新一版教材中重新提出,PE的治疗原则修改为休息、镇静、解痉、有指证降压、利尿,密切监测母胎情况,适时终止妊娠。尽管治疗方案的一再完善,但临床工作中发现,PE病情变化复杂、难以预测、不良妊娠结局时有发生；导致治疗效果欠佳的主要原因在于其发病机制尚未阐明,而现有的学说理论均未能对PE的发病作出完整的诠释并对其治疗进行有效指导。因此,探讨PE发生机制不仅是当前医学界面临的挑战,也是保护我国有限医疗资源,关乎社会经济发展的重要课题。近年来,研究表明可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)在妊娠过程中通过阻断血管内皮生长因子(VEGF)作用而参与PE的发病。sFlt-1是VEGF受体(Flt-1)的可溶性表达形式,因其缺乏胞外区及跨膜区这一结构的独特性,使其与VEGF结合后阻断其生物学效应,从而抑制胎盘血管形成,并增加内皮细胞对胎盘炎症因子的敏感性,起着促炎作用。早于2004年发表在新英格兰杂志上的巢式病例对照研究发现PE患者血清中sFlt-1表达明显高于孕周相同的正常孕妇(4382vs1643pg/mL,p0.01),文章还指出sFlt-1在PE临床症状出现前约5周即出现显著升高；同类的研究结果相继在国内外发表,发现sFlt-1在PE患者血清、胎盘及羊水中表达明显升高,并与病情严重程度呈正相关关系。因此,sFlt-1即将成为PE病情判断的重要指标。但目前众多研究成果多集中于sFlt-1表达的下游机制,而对sFlt-1产生的上游机制研究仍非常有限,因此,进行sFlt-1产生机制探讨,对阐明PE发病机制及从源头阻断其产生均具有重要意义。由于代谢障碍、炎症反应和肾功能减退等因素,PE患者普遍存在以氧化还原失衡为特征的氧化应激。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是一组在蛋白质、脂肪酸或核酸的氨基基团与还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应所形成的一系列具有高度活性终产物的总称。AGEs可与各种细胞表面晚期糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end-products, RAGE)结合,引起细胞内氧化应激,激活NADPH氧化酶,导致ROS产生增多,进而激活NF-κB,调控炎症因子的表达,这一过程在冠心病、糖尿病、自身免疫疾病的多种疾病中起重要作用。正常孕妇存在胰岛素抵抗状态,PE孕妇在此基础上存在氧化应激。另外研究显示AGEs在PE患者的血清和胎盘中的表达也明显高于正常孕妇,而滋养细胞表面也存在RAGE受体,实验中得出结果：PE患者血清中的AGEs浓度为157.8±51.9%(mean±S.D)；而正常孕妇则为116±31.6%,两者差异存在统计学意义(p0.005)。另外,AGEs与滋养细胞RAGE受体结合,可促进滋养细胞凋亡,进而影响胎盘着床。因此,总结上述研究结果：AGEs介导的滋养细胞损伤在PE的发生机制中可能起着重要的作用。尽管AGEs和sFlt-1都与PE的发生发展独立相关,但鉴于AGEs与其受体结合后可引起细胞内氧化应激,调控炎症因子的表达,而PE中,sFlt-1增加了内皮细胞对胎盘释放炎症因子的敏感性,也起着促炎作用。因此我们推测PE患者体内蓄积的AGEs与sFlt-1产生密切相关,故本课题以人早孕永生滋养细胞株HTR-8/SVneo为实验对象,以AGEs为刺激物,检测HTR-8/SVneo滋养细胞刺激后sFlt-1的分泌情况,并初步研究其产生机制。第一部分AGEs刺激滋养细胞分泌sFlt-1 [目的] 相关研究表明,AGEs-RAGE结合后可引起内皮细胞内氧化应激,调节炎症因子表达,而该系统在PE患者内被广泛激活；同样sFlt-1是参与子痫前期发病的重要“毒性因子”。因此本部分旨在探讨PE患者体内蓄积的AGEs与sFlt-1的相互关系,以AGEs为刺激物,检测滋养细胞内sFlt-1的分泌情况,以及AGEs对滋养细胞侵袭能力的影响。 [方法] 1、各组细胞侵袭能力测定： 1.1刺激分组：将HTR-8/SVneo滋养细胞分别予100μg/mLAGEs、100μg/mL BSA以及空白培养进行处理。 1.2将3组接受不同刺激细胞组置于铺Matrigel的Transwell小室上,孵育48h后,取小室行固定、染色,并置于光学显微镜下观察侵袭至Transwell下室的细胞并计数。 2、不同刺激浓度组sFlt-1mRNA表达及蛋白分泌量测定： 2.1刺激分组：将HTR-8/SVneo滋养细胞分别予浓度为0、50、100、200、300μg/mL AGEs刺激10h。 2.2刺激结束后RT-PCR检测细胞内sFlt-lmRNA表达,ELISA方法检测细胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情况。 3、不同刺激时间组sFlt-1mRNA表达及蛋白分泌量测定： 3.1刺激分组：以浓度为100μg/mLAGEs分别刺激HTR-8/SVneo滋养细胞O、2.5、5、10及15h。 3.2刺激结束后RT-PCR检测细胞内sFlt-1mRNA表达,ELISA方法检测细胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情况。 [结果] 1、各组HTR-8/SVneo滋养细胞侵袭能力改变：与BSA对照及空白培养基组对比,100μg/mL AGEs刺激滋养细胞后,穿透Matrigel侵袭至Transwell下室的细胞数明显减少(67.33±10.26vs145.33±5.50及67.33±10.26vs153.66±13.01,两者均p0.0001),而BSA对照组及空白培养基组之间无明显差异(p=0.350) 2、AGEs分别以不同浓度刺激HTR-8/SVneo滋养细胞后,sFlt-1的mRNA表达和蛋白的分泌情况：sFlt-1mRNA表达及细胞上清液蛋白表达经AGEs刺激后,各组sFlt-1的分泌较对照组呈AGEs剂量依赖性增加,差异有统计学意义(p0.05) 3、以浓度为100μg/mL AGEs分别刺激HTR-8/SVneo滋养细胞不同时间长度后,sFlt-1的mRNA表达和蛋白的分泌情况：sFlt-1mRNA表达及细胞上清液中sFlt-1蛋白分泌经100μg／mL AGEs不同时间长度刺激后,各组sFlt-1的分泌较对照组呈AGEs时间依赖性增加,差异有统计学意义(p0.05) [结论] 我们的实验结果提示AGEs刺激HTR-8/SVneo滋养细胞后,细胞侵袭能力明显受到抑制。同时,AGEs刺激HTR-8/SVneo滋养细胞,随刺激浓度及刺激时间增加及延长,sFlt-1的mRNA和蛋白分泌呈依赖性增加,提示PE患者体内蓄积的AGEs可是刺激其胎盘滋养细胞导致sFlt-1分泌增加,而这一过程可能参与PE的发病。第二部分：AGEs刺激HTR-8/SVneo滋养细胞分泌sFlt-1机制的研究 [目的] AGEs可激活内皮细胞内NADPH氧化酶,并导致活性氧ROS产生增加,调控各种炎症因子表达进而引起一系列病理反应,这一过程已经在糖尿病、动脉粥样硬化中被证实。结合第一部分研究结果,本部分旨在探讨AGEs刺激HTR-8/SVneo滋养细胞分泌sFlt-1机制的研究,证明AGEs刺激HTR-8/SVne。滋养细胞后可激活其内NADPH氧化酶,导致ROS产生,最终导致sFlt-1的分泌增加。 [方法] 1、DCFH-DA探针检测AGEs刺激各组HTR-8/SVneo滋养细胞后,细胞内ROS的产生情况： 1.1刺激分组： 1.1.1(浓度组)：将HTR-8/SVneo滋养细胞分别予AGEs浓度为0、50、100、200、300μg／mL刺激l0min；刺激终止后,行DCFH-DC探针装载。 1.1.2(抑制剂组)：分别予100μmol/LNADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)、10mmol/L ROS清除剂(NAC)预处理HTR-8/SVneo滋养细胞1h后予100μg/mLAGEs刺激1Omin；以单独AGEs刺激、BSA及空白培养基处理l0min为对照；刺激终止后,DCFH-DC探针装载。 1.2不同刺激后HTR-8/SVneo滋养细胞内ROS产生的检测： 1.2.1荧光显微镜下荧光强度观察：探针装载后,在避光环境下,将细胞置于蓝光激发的荧光显微镜下观察各组细胞内荧光强度变化。 1.2.2流式细胞仪行各组细胞荧光强度定量比较：探针转载后,将各组细胞消化、重悬,上机检测荧光强度(FITC)强弱变化。 2、各组HTR-8/SVneo刺激后sFlt-1mRNA表达及蛋白分泌量测定： 2.1刺激分组：分别予NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)、ROS清除剂(NAC)预处理HTR-8/SVneo滋养细胞lh后予100μg/mL AGEs刺激10h；以单独AGEs刺激、BSA及空白培养基处理为对照。 2.1刺激结束后RT-PCR检测细胞内sFlt-1mRNA表达及ELISA方法检测细胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情况。 [结果] 1、各组细胞内ROS产生情况： 1.1荧光显微镜下观察： 1.1.1AGEs浓度刺激组：各组细胞经AGEs刺激后,ROS产生导致的细胞内荧光强度随AGEs刺激浓度增加而逐渐增强。 1.1.2抑制剂处理组：分别予Apocynin及NAC预处理后,细胞内产生的ROS较单纯用AGEs刺激明显下降,但两预处理组之间无明显差别。1.2流式细胞仪检测各组ROS的产生情况： 1.2.1AGEs浓度刺激组：各组细胞经不同浓度AGEs刺激后,ROS产生导致的细胞内荧光强度变化较对照组呈AGEs浓度依赖性增加,差异有统计学意义(p0.05)；抑制剂处理组：分别予NADPH氧化酶抑制剂(Apocynin)及ROS清除剂(NAC)预处理后,细胞内产生的ROS较单纯用AGEs明显下降,且差异均具有统计学意义(2.8533±0.171vs4.8133±0.432,2.9067±0.197vs4.8133±0.432,p0.05),而两预处理组之间比较无统计学差异(p=0.619),但较空白培养基及BSA对照组比较,ROS产生明显增加,且差异均具有统计学意义(p0.05)。 2、各组细胞sFlt-1mRNA表达及细胞上清液蛋白分泌检测：预处理后,sFlt-1mRNA表达及细胞上清液蛋白分泌均较单纯用AGEs明显下降,且差异均具有统计学意义(p0.05),但两预处理组之间比较无统计学差异(p=0.612,0.805),但较空白培养基及BSA对照组比较,sFlt-1分泌量明显增加,且差异均具有统计学意义(p0.05)。 [结论] 我们的实验结果提示AGEs刺激HTR-8/SVneo滋养细胞后,细胞内ROS产生随刺激浓度升高而增加,予NADPH抑制剂(Apocynin)及ROS清除剂(NAC)预处理可使细胞内ROS产生及sFl t-1的分泌较单纯AGEs刺激减少。结合第一部分实验结果提出：AGEs刺激可使滋养细胞产生sFlt-1,本部分证明AGEs通过NADPH氧化酶依赖的信号途径使细胞内ROS的产生增加,最终导致是sFlt-1的产生增多,这一过程可能成为PE发病机制中的组成部分。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.246

【参考文献】