顺铂对子宫内膜癌细胞自噬的影响及其机制研究

发布时间：2018-06-13 08:25

本文选题：顺铂 + 子宫内膜癌细胞　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：子宫内膜癌的生物学发生是一个十分复杂的过程。但其确切发病机制尚不明确。研究提示,某些突变基因、癌基因的异常激活或抑癌基因的失活可能在子宫内膜癌的发生、发展过程中发挥了重要作用。因此,如果在子宫内膜癌的早期改变的发生阶段能够修复损伤的细胞成份,或者在子宫内膜癌发展阶段能够清除突变或损伤了的细胞成份,这将对子宫内膜癌提供更有效的治疗模式。因而寻找针对子宫内膜癌更有效的抗癌方法与途径,是近年来的研究热点。自噬是生物体自身降解细胞内损坏或折叠错误蛋白,完成受损细胞器清除,进而保持内环境稳定的重要方式,是一个古老的生物学现象,它广泛存在于单细胞生物、植物细胞和哺乳动物体中。它在正常细胞发育、细胞对环境刺激改变的反应以及哺乳动物肿瘤发生发展中占重要地位；在哺乳动物细胞中,是其清除癌细胞的重要手段之一。正常生理情况下,细胞自噬有利于细胞保持自稳状态；自噬是一个具有高度保守性的细胞代谢过程,它在营养缺乏、低氧、高热或药物诱导的情况下,能够降解折叠错误的蛋白、长周期蛋白和胞质内细胞器,是维持细胞内稳态的重要途径。从生物功能上讲,一方面,在发生应激时,细胞自噬可以防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器的累积,从而抑制细胞癌变；另一方面,肿瘤一旦形成,细胞自噬却为癌细胞提供更丰富的营养物质,从而促进肿瘤继续生长。综上所述,细胞自噬在肿瘤发生发展的过程中具有两面性。目前根据自噬发生过程不同可分为三类：大自噬(Macroautophagy),微自噬(Microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA),通常我们所指的自噬是大自噬,是细胞质中损伤或老化的蛋白质抑或细胞器以小泡形式转运到溶酶体中进行消化降解的过程；微自噬：是溶酶体直接、主动吞噬胞浆成分的另外一种方式；分子伴侣介导的自噬：一些分子伴侣,如hsp70,帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。自噬是一个有大量小分子蛋白质、细胞器及溶酶体参与的生物学过程,透射电镜下观察自噬体是人们在自噬过程中研究应用较多的和比较明确的一种研究手段,自噬相关蛋白--微管相关蛋白轻链3蛋白(green fluorescent protein and microtubule associated protein 1 light chain 3 fusionprotein, MAPLC3)也是常常被用于研究自噬的检测。在正常生理情况下,为了维持细胞内环境稳定的目的,细胞自噬的基础水平保持在一个比较低状态,但在某些“应激”状态下可以快速上调,如营养缺乏、生长激素缺乏、高热、药物诱导、细胞内出现过多的受损细胞器或代谢废物等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路是细胞生长和细胞增殖的重要调节因子。在人类中的同源基因是FRAP1 (FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),在哺乳动物中称为丝/苏氨酸蛋白激酶。大量研究显示mTOR信号途径调控异常与细胞增殖密切相关,是细胞增殖不可缺少的过程,能接受多种上游信号,如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化。许多肿瘤中可以发现mTOR通路过度表达。多种肿瘤细胞中,包括子宫内膜癌细胞,常存在磷酸酰肌醇-3激酶(MAPK)、蛋白激酶B (AKT)及丝裂原激活蛋白激酶,这些酶的激活可促进肿瘤细胞增殖,病情发展。该信号通路参与细胞增殖、细胞凋亡、分化和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。该通路中的PI3K活性增加常与多种癌症相关。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是该通路中PI3K最常用的激动剂。细胞自噬是一系列相关基因严格调控的生物学过程,是一个相当复杂的过程。研究表明,自噬调控过程的异常与子宫内膜癌的发生、发展密切相关。顺铂为子宫内膜癌的一线化疗药物,其是否影响子宫内膜癌细胞的自噬,及其机制仍亟待阐明。mTOR作为氨基酸、能量和营养状态的感受器,激活或抑制其上游各种信号因子均可能引起其自身活性的变化,同时亦可通过自身调节下游自噬复合物的生成,从而发挥对细胞自噬的直接调控作用。因此,弄清mTOR通路在顺铂对子宫内膜癌自噬的可能作用机制将有助于人类从分子水平上对子宫内膜癌进行分析和治疗。本实验将研究在子宫内膜癌中顺铂与自噬之间的关系及其发生机制,拟定在体外培养Ishikawa子宫内膜癌细胞,用不同浓度和不同时间顺铂处理ishikawa细胞,MTS检测细胞活力,浓度梯度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、 80μg/mL,每个浓度设为0 h、12 h、24 h、48 h、72h五个时间点。选出IC50剂量并确定下一步顺铂的药物浓度及作用时间。选取20 μ g/mL,0 h、12 h、24h三个时间点进行分组,利用透射电镜观察自噬泡形成,并通过荧光显微镜观察微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(GFP-LC3)的荧光聚集情况,检测顺铂能否诱导Ishikawa子宫内膜癌细胞发生自噬；应用Westerblot检测mTOR通路中的PI3K、AKT及mTOR蛋白的累积。为了进一步明确mTOR通路在顺铂对子宫内膜癌自噬中的作用,应用胰岛素样生长因子-1(PI3K激动剂,100ng/ml)与顺铂(20μg/mL,24 h)共培养,利用透射电镜观察自噬泡形成,荧光显微镜观察微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(GFP-LC3)的荧光聚集情况检测自噬。本研究阐明了顺铂对子宫内膜癌细胞自噬的影响及其可能的作用机制,为子宫内膜癌的治疗提供新的靶点并奠定实验基础。研究背景和目的研究背景1、子宫内膜癌发病率在全球范围内逐年上升。子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一种上皮性恶性肿瘤,是女性生殖道肿瘤中最常见的三大恶性肿瘤之一,以中老年妇女为多见。随着肥胖人群增多、人类寿命的延长以及内外源性激素使用的增多,其发病率在全球范围内呈上升趋势,由于宫颈筛查的普及,部分发达国家已超过宫颈癌。早期子宫内膜腺癌手术效果好,五年生存率达90%以上,但如患者就诊时已经是晚期,预后差,五年生存率仅约30%,对于晚期及复发子宫内膜癌患者,化疗为其重要的治疗手段,因此如何对晚期及复发性子宫内膜癌的患者寻找合适的治疗方案是非常重要且必要的。目前,从分子生物学的角度研究化疗药物对子宫内膜癌的抗癌作用机制已成为学者们关注的一个焦点。2、自噬与子宫内膜癌的发生发展密切相关。自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡(type II programmed cell death)是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白、折叠错误蛋白和老化细胞器的自噬小体为特征的细胞内“自我消化”的一系列生化过程,是细胞在生理或病理(如饥饿、高热、低氧或缺氧、药物诱导等)的作用下形成具有独立双层膜结构的自噬泡；有研究显示,不典型增生子宫内膜细胞(癌前病变)其自噬活性比正常子宫内膜增强,腺癌则自噬活性明显减弱。根据自噬的演变过程,自噬一方面可以维持并促进肿瘤细胞生存,另一方面,细胞自噬在肿瘤的某些发展阶段又能抑制肿瘤发生。作为机体的一种保护性机制,自噬活性增强,可能导致相关蛋白质处于负平衡,抑制细胞恶变。但当自噬作用不能修复这种细胞内异常时,不良因素进一步累积,最终导致细胞癌变。3、顺铂是子宫内膜癌化疗的一线药物,进一步了解顺铂作用于子宫内膜癌细胞后与自噬的关系具有重大意义。顺铂(cisplatin, CP)是一种含铂类化疗药物,在临床应用极为广泛,为非细胞周期依赖性化疗药物,其在晚期及复发性子宫内膜癌的化疗中具有重要的地位。因此,进一步了解顺铂作用在子宫内膜癌化疗中的细胞毒性的机制非常必要。在不同组织和细胞的研究中,顺铂引起的细胞自噬功能各异。顺铂在肝癌细胞Huh-7和HepG2中通过下调miR-199a-5p进而激活Atg7增强自噬,并研究发现肿瘤细胞通过自噬诱导癌细胞耐药。然而,在喉癌细胞Hep-2的研究中,使用3-MA或敲除Beclin-1抑制自噬,能够增强顺铂引起的细胞凋亡。自噬在肿.瘤治疗中的作用非常复杂,在不同的肿瘤不同的药物中的作用以及机制都可能不同,因此了解顺铂作用于子宫内膜癌细胞后与自噬的关系,自噬处与何种地位及其作用机制如何至关重要。4、子宫内膜癌的发展及不良预后与PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活密切相关。PI3K/Akt通路的下游分子是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。mTOR是一种保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,是调节细胞生长、增殖、存活和自噬等的汇合点。mTOR信号通路是细胞分裂和合成代谢的调节中心,与蛋白合成、细胞周期的调控相关,为细胞启动翻译信号及细胞由Go/G1期进入S期所必需。研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活均与子宫内膜癌的发展及不良预后有关。PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活与子宫内膜癌中基因的改变对肿瘤的进展也有密切联系。研究发现P13K的催化活性增强,进而激活PI3K/Akt通路,最终促进细胞的癌变。子宫内膜癌中PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度表达,最终促进细胞继续发生癌变。研究目的自噬作为细胞程序性死亡,为目前肿瘤治疗的新靶点,目前仍然有很多分子机制仍有待于进一步阐明。本研究分析顺铂对子宫内膜癌是否能引起自噬,并揭示相关发生机制,为顺铂在子宫内膜癌治疗作用中进一步完善自噬机制关系理论提供实验依据。方法体外培养Ishikawa细胞,用不同浓度和不同时间顺铂处理ishihawa细胞,MTS检测细胞活力,浓度梯度为10μ g/mL、20μ g/mL、40 μ g/mL、80μg/mL,每个浓度设为0 h、12 h、24 h、48 h、72h五个时间点。选出IC50剂量并确定下一步顺铂组的药物浓度及作用时间。根据MTS结果,选取20μ g/ml,作用时间为0h、12 h、24 h,利用透射电镜观察自噬泡形成,并通过荧光显微镜观察微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(GFP-LC3)的荧光聚集情况检测顺铂能否诱导Ishikawa子宫内膜癌细胞发生自噬；应用Westerblot检测mTOR通路中的PI3K、AKT及nTOR蛋白的累积。为了进一步明确mTOR通路在顺铂对子宫内膜癌自噬中的作用,应用胰岛素样生长因子-1(PI3K激动剂,100ng/ml)与顺铂(20 μ g/mL,24 h)共培养,利用透射电镜观察自噬泡形成,荧光显微镜观察微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(GFP-LC3)的荧光聚集情况再次检测细胞自噬情况。统计学处理数据以平均数加标准差(means±SD)或平均数加标准误(means±SEM)表示,应用SPSS 19.0软件进行统计学分析,通过方差分析和配对t检验,P0.05为差异有统计学意义。结果顺铂对Ishikawa细胞增殖的影响MTS结果显示,Ishikawa细胞对顺铂作用敏感,10μg/mL顺铂作用24小时后,对Ishikawa细胞的增殖有抑制作用,10μg/mL处理12小时、24小时、48小时和72小时后,增殖抑制率分别为18.27±2.25,24.88±3.58,38.27±5.34,45.43±4.25。随着时间及浓度的增加,细胞增殖的抑制作用明显增加(P0.01)。20μg/ml顺铂处理组,细胞增殖抑制率在所有时间点均小于50%。40μg/ml和80μg/ml顺铂处理组,细胞增殖抑制率在所有时间点均大于50%。根据MTS检测结果,20μg/ml顺铂处理0小时、12小时和24小时被选作为下面实验的浓度和时间点。顺铂对Ishikawa细胞自噬的影响应用透射电镜观察20μg/ml顺铂处理0小时、12小时和24小时处理后的ishihawa细胞中自噬体形成情况。20μg/ml顺铂处理ishihawa细胞培养12小时后,细胞内出现双层膜组成的自噬体。20μg/ml顺铂处理ishihawa细胞培养24小时后,细胞内空泡明显,自噬体聚集。与对照组相比,20μg/ml顺铂培养12小时组的细胞内自噬体增加；20μg/ml顺铂培养24小时组较12小时组的细胞内自噬体增加；应用免疫荧光共聚焦检测自噬相关蛋白LC3的表达,结果显示,20μg/ml顺铂培养24小时组较12小时组的LC3表达增加,20μg/ml顺铂培养12小时组LC3表达高于对照组。因此,顺铂对子宫内膜癌细胞具有促进自噬的作用,并呈时间剂量依赖型。顺铂对mTOR信号通路的抑制作用为了检测顺铂促进ishihawa细胞自噬的作用机制,western blot检测PI3Kp85,磷酸化AKT1,总AKT1,磷酸化mTOR;和总mTOR蛋白的表达。结果显示,20ug/ml顺铂处理24小时后较12小时组,磷酸化AKT1、磷酸化mTOR及PI3Kp85表达水平明显下降；20ug/ml顺铂处理12小时组与对照组比较,上述蛋白也明显下降。但总AKT1及mTOR表达水平未见明显变化。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)与顺铂共培养逆转顺铂对子宫内膜癌细胞自噬的作用为进一步验证顺铂引起ishihawa细胞自噬是通过抑制mTOR信号通路,设立三个组,对照组,顺铂组(20ug/ml,24小时)及共培养组(IGF-1100ng/ml与顺铂20ug/m1,24小时),透射电镜检测自噬小体,Western blot检测LC3蛋白表达情况。结果显示,应用IGF-1激活PI3K/Akt/mTOR信号通路的共培养组透射电镜检测自噬小体及LC3蛋白表达均少于顺铂组,但高于对照组。结论1、10μ g/mL,24小时顺铂对子宫内膜癌细胞的增殖有抑制作用,呈时间剂量依赖型；2、顺铂对子宫内膜癌细胞具有促进细胞自噬的作用；呈时间依赖型；是顺铂的抗肿瘤性作用机制之一3、顺铂通过对mTOR信号通路的抑制作用,从而促进子宫内膜癌细胞发生自噬,是顺铂诱导子宫内膜癌细胞发生的作用机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

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