miR-21通过抑制PTEN促进宫颈癌细胞增殖和迁移的研究

发布时间：2018-06-26 05:50

本文选题：宫颈癌 + miR-21　；参考：《武汉大学》2016年博士论文

【摘要】：背景宫颈癌是全世界范围内女性中最常发生的恶性肿瘤之一,其目前的发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。尽管近些年来由于HPV筛查和早期诊断技术的应用,宫颈癌发生率在发达国家中呈逐年下降的趋势,但在发展中国家由于医疗条件的限制,宫颈癌任然是导致女性死亡的主要原因之一。在中国,宫颈癌在女性恶性肿瘤发生率中居第一位。关于宫颈癌的发生机制,前人已进行了一定的研究。如在宫颈中持续注射高危的人类乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)会促进宫颈癌的发生；而癌基因蛋白HPVs E5、E6和E7也能单独促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。另外,有研究显示血管内皮生长因子VEGF-C、蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2以及CD147-4等一些分子也能通过一定的机制促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。相对的,一些肿瘤抑制分子女Beclinl、HDAC10等也可以通过一定的机制抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移。近年来,越来越多的研究显示microRNAs在宫颈癌的发生发展中也发挥着重要的作用。如miR-135a、miR-10a和miR-205的异常高表达可以分别通过下调β-catenin、CHL1和CYR61、CTGF来促进宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭；而肿瘤抑制microRNAs如miR-218、miR-372和miR-214的表达缺失也会促进宫颈癌的发生。另外,大量研究显示具有广泛致癌作用的miR-21在非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌以及食管癌中异常高表达,可以通过调控PTEN信号通路来促进肿瘤的发生,但miR-21在宫颈癌发生发展中的作用尚很少有人进行过系统研究。因此,本研究中我们检测了宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21和PTEN的表达情况,发现miR-21在宫颈癌中异常高表达,并与PTEN的表达呈负相关；然后我们在宫颈癌CaSki细胞和HeLa细胞中研究了miR-21对细胞增殖、迁移和和侵袭能力的影响；最后我们研究了miR-21对PTEN表达的调控机制。本研究通过上述实验最终证明miR-21的异常高表达可以通过抑制PTEN信号通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。第一部分宫颈癌组织中miR-21高表达,并与PTEN表达呈负相关目的：检测miR-21在临床宫颈癌患者肿瘤组织和正常人宫颈组织中的表达水平,分析二者之间是否存在显著差异,从而阐明miR-21表达水平与宫颈癌发生的相关性。并进一步研究上述宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21表达水平与抑癌基因PTEN的表达是否存在相关性,以及miR-21表达水平与患者HPV阳性/阴性是否存在相关性,为探讨miR-21在宫颈癌发生中的作用奠定基础。方法：收集了36例宫颈癌患者的肿瘤组织样本作为实验组,21例正常人的宫颈组织样本作为对照组,用TRIzol破裂组织并提取mRNA。运用Superscript First-Strand Synthesis System for the RT-PCR kit,引物用其中的随机Uni-12引物,获得各组织的cDNA。设计针对PTEN的特异性引物及Taqman引物,以各组织cDNA为模板,使用Taqman探针法进行实时定量PCR (Real-Time PCR)实验,检测PTEN在上述各组织中的mRNA表达水平。以β-actin作为内参,标定其表达量。用mirVana miRNA Isolation kit提取microRNA,用mirVana RT-qPCR miRNA Detection kit对miR-21进行定量分析,U6小核RNA作为内部参照。对得出的结果进行统计学分析,考察宫颈癌组织中miR-21和PTEN的表达水平是否具有相关性。同时由于这36例宫颈癌样本中有28例HPV阳性、8例阴性,通过统计分析研究miR-21表达水平与HPV阳性/阴性的相关性。结果：将21例正常人宫颈组织中miR-21的平均表达值设为1.00±0.09,而36例宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21的平均表达值为2.14±0.19,说明宫颈癌组织中miR-21显著高表达(P0.001)。此外,这36例宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21高表达时,PTEN表达水平显著较低(P0.001),二者的表达水平呈显著负相关性(R2=0.2713,P=0.0011)。而HPV阳性/阴性的宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21的表达没有明显差异。结论：宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21高表达,并与PTEN的表达呈负相关；miR-21的表达水平与HPV阳性/阴性无显著相关性。第二部分miR-21过表达对宫颈癌细胞体外生物学行为的影响目的：在宫颈癌CaSki和HeLa细胞中转染miR-21 mimics、miR-21抑制剂或miRNA对照,研究miR-21表达水平改变对宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响,从而阐明miR-21在宫颈癌发生中的作用。方法：用含10%胎牛血清的RPMI-1640或者DMEM,37℃,5%CO2浓度的环境下培养宫颈癌CaSki细胞和HeLa细胞；使用Lipofectamine 2000试剂将miR-21 mimics、miR-21抑制剂和miRNA对照分别转染进入宫颈癌CaSki细胞和HeLa细胞中；使用Real-Time PCR检测转染效果,并将转染好的上述细胞分别进行细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的检测。首先,将上述转染好的细胞在CCK-8孵育,在24h时检测细胞在450nm下的吸光度,检测miR-21表达水平改变对上述细胞增殖能力的影响；另外,同样将上述转染好的细胞在CCK-8孵育,分别在0、24、36和48h时检测细胞在450nm下的吸光度,从而研究miR-21表达水平改变后上述细胞增殖能力随时间的变化情况。其次,将上述转染好的细胞计数300个细胞后在正常培养基中孵育,48h后用0.005%的结晶紫染色20min, Image J软件统计克隆数,研究miR-21表达水平改变对宫颈癌细胞克隆形成能力的影响。再次,将上述转染好的细胞接种到12孔板中至密度为85%,进行划痕愈合实验,然后分别在0、24、48h观察划痕愈合请况,检测miR-21表达水平改变对宫颈癌细胞迁移能力的影响。最后,用Matrigel包被好Transwell小室,将上述转染好的细胞悬浮于无血清培养基中,放于小室上层,小室浸泡在20%血清的培养基中,24h后观察穿过Matrigel后附着于基底膜的细胞并计数,以确定miR-21表达水平改变对宫颈癌细胞侵袭能力的影响。结果：在CaSki和HeLa细胞中转染miR-21 mimics可以使miR-21的表达水平显著上升,而转染miR-21抑制剂则可以导致miR-21的表达水平显著下降。与对照组相比,转染miR-21 mimics后CaSki和HeLa细胞的增殖能力显著增加,形成的克隆数显著增多,细胞划痕实验中划痕愈合速度显著加快,Transwell实验中穿。过Matrigel的细胞数显著增多；而转染。miR-21抑制剂后CaSki和HeLa细胞的增殖能力显著降低,形成的克隆数显著减少,细胞划痕实验。中划痕愈合速度显著变慢,Transwell实验中穿过Matrigel的细胞。数显著减少。结论：miR-21过表达可以显著提高宫颈癌CaSki细胞和HeLa细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力,说明miR-21是宫颈癌的一个癌基因,miR-21高表达对宫颈癌的发生和发展具有显著促进作用。第三部分miR-21通过抑制PTEN调控宫颈癌细胞的增殖目的：前期工作发。现宫颈癌患者肿瘤组织中miR-21高表达,PTEN低表达,两者表达水平呈。显著负相关。为了明确miR-21和PTE N的上下游关系,研究。miR-21发挥作用的分子机制进行了本部分的研究。方法：在宫颈癌CaSki细胞和HeLa细胞中分别转染miR-21 mimics和miRNA对照,通过Real-Time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测PTEN的变化,以确定PTEN是否作用在miR-21下游。通过分子克隆手段构建PTEN-pcDNA3.1质粒,将其稳定转染到宫颈。癌CaSki细胞中使其过表达PTE N基因,通过Real-Time PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测PTEN的表达水平,以确定是否成功过表达PTEN基因；然后通过CCK-8实验检测过表达PTEN对细胞增殖能力的影响,通过克隆形成实验检测过表达PTEN对细胞克隆形成能力的影响,从而最终确定miR-21是否通过PTEN影响细胞的增殖能力。结果：与对照组相比,在宫颈癌CaSki细胞和Hela细胞中转染miR-21 mimics后,PTEN基因在mRNA和蛋白水平上的表达量均有显著降低。构建的PTEN-pcDNA3.1质粒能够在CaSki细胞成功过表达PTEN基因,而过表达PTEN基因后,CaSki细胞的增殖能力和克隆形成能力显著下降。结论：宫颈癌细胞中转染miR-21 mimics能明显降低PTEN的表达水平,PTEN是miR-21的下游基因,而miR-21影响细胞的增殖能力也是通过抑制PTEN来实现的。
[Abstract]:Cervical cancer is one of the most frequently occurring malignant tumors in the world . The incidence of cervical cancer is the second in the malignant tumor of women . Although the incidence of cervical cancer has declined year by year in developed countries due to the application of HPV screening and early diagnosis technology , cervical cancer is the first cause of female death in developing countries . In China , cervical cancer is the first leading cause of female death . In China , cervical cancer has been studied in a certain way .
In addition , some molecules such as VEGF - C , protein tyrosine phosphatase SHP - 2 and CD147 - 4 can promote the proliferation , migration and invasion of cervical cancer cells .
In addition , the expression of miR - 21 and PTEN in non - small cell lung cancer , colorectal cancer , ovarian cancer , breast cancer and esophageal cancer can be promoted by controlling PTEN signal pathway .
Then , we studied the effects of miR - 21 on cell proliferation , migration and invasion ability in cervical cancer cells and HeLa cells .
The expression level of miR - 21 in cervical cancer patients and the expression level of miR - 21 in human cervical tissues were analyzed by using the method of Superscript First - Strand Synthesis System for the RT - PCR kit . Conclusion : The expression of miR - 21 in cervical cancer patients was negatively correlated with the expression of PTEN . Conclusion : The expression of miR - 21 in cervical cancer patients was negatively correlated with the expression of PTEN .
The expression level of miR - 21 was not significantly correlated with HPV positive / negative . The effect of miR - 21 overexpression on the biological behavior of cervical cancer cells was investigated . The effects of miR - 21 expression level on the proliferation , migration and invasion ability of cervical cancer cells were investigated .
The miR - 21 inhibitor , the miR - 21 inhibitor and the miRNA control are respectively transfected into cervical cancer cells and HeLa cells by using the Lipofectamine 2000 reagent ;
firstly , the transfected cells are incubated in CCK - 8 , the absorbance of the cells at 450 nm is detected at 24h , and the influence of the miR - 21 expression level change on the cell proliferation ability is detected ;
The effect of miR - 21 expression level on the invasion ability of cervical cancer cells was investigated . After 24 hours , the transfected cells were cultured in a medium containing 20 % serum , then the transfected cells were incubated with 0.005 % crystal violet for 20 minutes . The results showed that the expression level of miR - 21 was significantly increased after 24 h .
Conclusion : miR - 21 overexpression can significantly improve the proliferation , clonal formation , migration and invasion ability of cervical cancer cells .
The results showed that the expression level of PTEN gene was significantly lower than that of control group , and the expression level of PTEN gene was significantly lower than that of control group . Conclusion : The expression level of PTEN gene was significantly lower than that of control group .
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

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