c-Met及抑制剂在卵巢上皮性癌凋亡的实验研究

发布时间：2018-06-27 09:04

本文选题：c-Met + 化疗　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：来源于卵巢组织的恶性肿瘤是全球七大癌症之一,新发病例中约有80%以上病例为III期-IV期,较早出现远处转移。近二十年,卵巢癌发病率虽有所下降,死亡率却是仍居高不下。卵巢癌发病隐匿、早期诊断较难,早期即多处扩散转移、术后易出现复发及耐药,致使卵巢癌患者死亡率为女性三大生殖器肿瘤之首。随着卵巢癌肿瘤细胞减灭术广泛应用、紫杉醇等一线化疗药物的应用及分子生物学手段日新月异,I期患者生存率有了显著提高,五年生存率能达到90%左右。III/IV期患者通常经过约两年时间治疗,多数病例出现复发或耐药,因此五年存活率仅有25-30%。卵巢癌的发生、早期即远处转移、耐药等是异常复杂的过程,多数病例就诊时无特异性症状,高雌激素刺激、精神心理、遗传等相关因素导致疾病发展。多步骤、多因素、多种关键分子或信号通路所致,通过影响卵巢癌细胞周期调控、增殖、迁移和侵袭,促进卵巢癌的发生发展。原癌基因c-Met(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor)位于细胞膜,高亲和力配体为肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)。c-Met在肿瘤组织中表现为过表达或异常活化,在甲状腺癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、结直肠癌组织学及细胞系中均已证实。c-Met位于人7号染色体(7q),具有酪氨酸激酶活性,参与多种细胞功能活动。c-Met基因突变或c-Met蛋白过度表达激活下游多条信号通路PI3K/Akt、MAPK、STAT、Notch,影响细胞的增殖、运动、凋亡,调控细胞周期。研究发现,肿瘤细胞中c-Met蛋白过表达,肿瘤细胞会表现出更强的迁移、侵袭以及抗凋亡能力。研究证实减少c-Met蛋白过表达或者阻止c-Met自磷酸化及下游通路可有效调控肿瘤细胞的增殖、迁移,并增强细胞凋亡能力。针对c-Met蛋白这一肿瘤重要靶标,现已研发出特异性小分子抑制剂作为抗癌药物。c-Met小分子抑制剂分为三型,Ib型抑制剂具有高选择性,精确的结合c-Met非磷酸化构象结合位点,作为这类抑制剂的代表药物Capmatinib(INCB28060,苯扎米特),目前应用于晚期肝癌、结肠癌、非小细胞肺癌、直肠癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤进行I/II期临床研究阶段。国内外尚无文献报道c-met抑制剂incb28060对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,也无联合紫杉醇对卵巢癌细胞增殖和凋亡的研究,incb28060是否能有效抑制c-met及其下游pi3k/akt/mtor信号通路,同时incb28060联合紫杉醇对c-met下游信号通路pi3k/akt/mtor是否有作用,是否影响卵巢癌生物学行为。本研究以卵巢癌组织、正常卵巢组织、体外培养的卵巢癌skov3、ovcar-3细胞系、卵巢癌裸鼠荷瘤模型为研究对象,通过免疫组化、实时定量rt-pcr、western-blot等方法检测c-met在卵巢癌组织、正常卵巢组织的表达情况;通过incb28060抑制c-met蛋白的表达,运用实时定量rt-pcr、流式细胞术、western-blot、mtt、tunel等技术,研究c-met蛋白在skov3、ovcar-3细胞中的表达、对下游pi3k/akt/mtor信号通路的影响、对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响;构建裸鼠荷瘤模型,了解incb28060抑制c-met蛋白表达后荷瘤裸鼠模型肿瘤体积变化,c-met及下游通路pi3k/akt/mtor变化;以阐明c-met在卵巢癌细胞增殖、凋亡过程中的重要影响,可能为卵巢癌基因治疗探寻潜在靶向药物提供理论依据。第一部分c-met在卵巢癌中的临床病理表达目的:探讨c-met在卵巢癌、正常卵巢组织中的表达情况及其与卵巢癌临床病理特征的关系。方法:选取2012.1-2012.12在河北医科大学第四医院经手术病理证实为上皮性卵巢癌标本104例作为研究对象,及同期行子宫加双附件切除术,病理证实为正常卵巢组织26例为对照组。采用免疫组化、rt-pcr及western-blot方法比较c-met在卵巢癌组织及正常卵巢组织中的表达情况。选取研究组病例患者年龄25-74岁之间,中位年龄55岁。figo分期:i-ii期32例,iii-iv期72例。组织学分级:g1级19例,g2-g3级85例。淋巴结转移55例,无淋巴结转移病例49例。选取同期26例行子宫加双附件切除术且病理证实卵巢无病变者为对照组。所有标本分两组,一组10%福尔马林固定,一组投入液氮后再冷冻至-80℃待用。结果:1c-met在上皮性卵巢癌细胞的细胞浆及部分胞膜表达,104例卵巢癌组织阳性率表达为74.04%;c-met在正常卵巢组织细胞中表达较少,阳性表达率为11.54%,两组比较有统计学差异(p0.05)。2c-met在卵巢癌组织学分级g1级阳性表达率为52.63%、g2/g3级中阳性表达率为85.88%,比较两组数据有统计学差异(p0.05);c-met蛋白在卵巢癌i/ii期组织中阳性表达率为53.12%,iii/iv期组织中阳性表达率为88.87%,比较两组数据有统计学差异(p0.05);c-met在卵巢癌有淋巴结转移组表达率为92.72%,无淋巴结转移组表达率为67.35%,比较两组数据有统计学差异(p0.05)。3rt-pcr结果显示c-met在卵巢癌组织相对表达量(3.0786±0.09)高于正常卵巢组织中的相对表达量(1.0009±0.001),比较两组数据有统计学差异(p0.05)。4western-blot结果显示c-met蛋白在卵巢癌组织的相对表达量为(0.979±0.009),明显高于正常卵巢组织中的(0.263±0.003),两组比较有统计学差异(p0.05)。结论:c-met在卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织,提示c-met可能参与卵巢癌的发生;c-met蛋白在卵巢癌组织中的表达与临床分期、组织学级别、淋巴结转移相关,提示c-met参与卵巢癌的发生、发展、远处转移。第二部分incb28060对卵巢癌细胞体外凋亡作用研究目的:探讨incb28060作用卵巢癌细胞系c-met、pi3k/akt、细胞增殖、细胞凋亡的影响。方法:利用rt-pcr、wertern-blot、mtt、tunel、流式细胞术检测卵巢癌skov3、ovcar-3细胞c-met的表达情况;向细胞系中加入不同浓度incb28060,采用mtt法检测抑制剂对卵巢癌细胞存活率的影响,流式细胞术、jc-1探针检测细胞膜线粒体去极化和细胞周期变化;向细胞株中加入相同浓度incb28060但作用时间不同,采用mtt法检测其对细胞存活率的影响;向细胞株加入不同浓度紫杉醇,采用mtt法检测incb28060+紫杉醇对细胞存活率的影响;向细胞株加入同一浓度紫杉醇但作用时间不同,采用mtt检测其对细胞存活率的影响;向细胞株加入incb28060,采用wertern-blot法检测对c-met及下游通路pi3k/akt的影响,检测p-c-met、p-pi3k、p-akt1、mtor、mdm2和p53的表达;应用incb28060联合紫杉醇作用细胞,wertern-blot检测细胞dna损伤修复标志物γh2ax的表达;用incb28060联合紫杉醇处理细胞,应用tunel检测细胞凋亡情况;结果:1incb28060处理卵巢癌skov3、ovcar3细胞,与对照组相比用不同浓度(0umol/l、2umol/l、4umol/l、6umol/l和8umol/l)的incb28060作用处理细胞,skov3、ovcar3细胞存活率随incb28060浓度的增加而下降,提示incb28060对细胞存活率的影响为剂量依赖性,以6umol/l浓度最佳,skov3细胞存活率(50.12±2.369%)与对照组细胞存活率(97.23±3.71%)相比,有统计学差异(p0.05);ovcar-3细胞存活率(65.72±1.996%)与对照组细胞存活率(97.62±2.98%)相比,有统计学差异(p0.05)。2incb28060处理skov3、ovcar3细胞,mtt检测6umol/lincb28060不同培养时间(0h、12h、24h、36h和48h)细胞存活率,结果显示,skov3、ovcar3细胞存活率随作用时间延长而下降,提示incb28060对卵巢癌细胞的影响是呈时间依赖性的,以24h为最佳,skov3细胞存活率(51.92±1.996%)与对照组细胞存活率(98.19±3.69%)相比,有统计学意义(p0.05);ovcar3细胞存活率(63.27±3.061%)与对照组细胞存活率(96.91±3.84%)相比较有统计学差异(p0.05)。3单独应用6umol/lincb28060以及联合紫杉醇与skov3、ovcar-3细胞共同培养,mtt检测不同浓度紫杉醇(0nm、10nm、20nm、30nm、40nm)对细胞存活率的影响,结果显示,紫杉醇浓度以20nm最佳,skov3、ovcar3细胞存活率依剂量增加而降低,呈剂量依赖性;skov3细胞存活率为(49.91±2.167%)与对照组细胞存活率(98.23±3.994%)相比较,有统计学差异(p0.05);ovcar-3细胞存活率为(59.72±1.991%)与对照组细胞存活率(97.83±3.269%)相比较有统计学差异(p0.05);单独应用6umol/lincb28060以及联合20nm紫杉醇处理skov3、ovcar-3细胞,mtt检测不同作用时间(0h、12h、24h、36h、48h)对细胞存活率的影响,结果显示,作用时间以24h最佳,skov3、ovcar-3细胞存活率依时间延长而降低,呈时间依赖性;skov3细胞存活率为49.91±2.167%与对照组细胞存活率96.23±3.99%相比较有统计学差异(p0.05);ovcar-3细胞存活率为53.17±2.02%与对照组细胞存活率96.19±4.10%相比较有统计学差异(p0.05);4不同浓度incb28060与skov3、ovcar-3细胞共培养,检测c-met、p-c-met、p-pi3k、p-akt的表达。结果显示,应用抑制剂incb28060的卵巢癌skov3、ovcar3细胞p-c-met、p-pi3k、p-akt蛋白表达量随着incb28060浓度增加表达下降,呈剂量依赖性,有统计学差异(p0.05)。5流式细胞仪检测不同浓度incb28060与skov3、ovcar-3细胞共培养,细胞线粒体去极化膜电位比例以及去极化与极化比值。结果显示:随着浓度增加两株细胞线粒体去极化比例增加,以6umol/l最佳,skov3细胞线粒体膜电位去极化比例为(65.77±3.26%),与对照组相比较(8.41±0.26%),有统计学差异(p0.05);ovcar-3细胞线粒体膜电位去极化比例为(56.81±2.51%),与对照组相比较(7.34±0.30%),有统计学差异(p0.05);流式细胞仪检测细胞去极化与极化比例,结果显示:随着incb28060浓度增加,比例随之增加,skov3细胞线粒体去极化与极化比值为(0.83±0.041%),与对照组相比较(0.17±0.006%),有统计学差异(p0.05);ovcar-3细胞线粒体去极化与极化比值为(0.77±0.039%),与对照组相比较(0.18±0.006%),有统计学差异(p0.05);6incb28060对skov3、ovcar-3细胞dna损伤能力的影响应用westernblot检测γh2ax,观察6umol/lincb28060及联合20nm紫杉醇对skov3、ovcar3细胞γh2ax的影响,结果显示,incb28060及联合紫杉醇对skov3、ovcar3细胞共培养细胞dna损伤程度增强,与对照组相比,有统计学差异(p0.05)。7流式细胞学检测incb28060及联合紫杉醇对skov3、ovcar-3细胞周期影响incb28060联合紫杉醇作用于skov3、ovcar-3细胞。共同作用随时间递增,incb28060联合紫杉醇作用skov3细胞g2/m期细胞比例(23.44±1.026%),明显低于单用incb28060组细胞g2/m期细胞比例(29.99±1.391%),有统计学差异(p0.05);incb28060联合紫杉醇作用ovcar-3细胞处于g2/m期细胞比例(21.17±1.167%),明显低于对照组(31.73±1.4%),有统计学差异(p0.05);incb28060联合紫杉醇作用skov3细胞sub-g1期比例(47.26±1.98%),与单用incb28060(21.78±1.01%)或紫杉醇组(18.71±0.92%)比较,有统计学差异(p0.05);incb28060联合紫杉醇作用ovcar-3细胞sub-g1期比例(43.94±2.0016%),与单用incb28060(18.73±0.95%)或紫杉醇组(21.16±1.06%)比较,有统计学差异(p0.05);结论:1应用incb28060抑制卵巢癌skov3、ovcar-3细胞存活率,存在剂量依赖性及时间依赖性。2应用incb28060抑制卵巢癌skov3、ovcar-3细胞c-met蛋白表达。3应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞抑制c-met下游通路pi3k/akt。4应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞,抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。5应用incb28060作用卵巢癌skov3、ovcar-3细胞,可能增加肿瘤细胞对化疗药物紫杉醇敏感性。第三部分incb28060联合紫杉醇作用于卵巢癌裸鼠荷瘤模型的实验观察目的:构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型,并观察incb28060联合紫杉醇对卵巢癌裸鼠荷瘤模型的作用。方法:1培养卵巢癌skov3、ovcar-3细胞株;2构建裸鼠荷瘤模型;3incb28060及紫杉醇干预裸鼠荷瘤生长;4westernblot法检测肿瘤细胞c-met及下游通路pi3k/akt表达情况。结果:1成功构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。2应用incb28060及紫杉醇干预卵巢癌裸鼠荷瘤模型,结果提示,incb28060+紫杉醇联合用药组的肿瘤体积最小(540.19±26.11mm3),与对照组(930.22±29.10mm3)比较有统计学差异(p0.01)。incb28060+紫杉醇联合用药组的肿瘤质量最轻(900.094±56.099mg),与对照组(1630.194±68.031mg)比较有统计学差异(p0.01)。incb28060+紫杉醇联合用药组的裸鼠荷瘤模型体重(2150.987±0.096mg),与对照组(2070.238±0.079mg)比较无统计学差异(p0.05)。3 Western blot法对肿瘤组织的c-Met、p-c-Met、PI3K、p-PI3K、AKt1、p-AKt1、mTOR、p-mTOR、mdm2、p53蛋白表达情况。结论:1成功构建卵巢癌裸鼠荷瘤模型。2应用INCB28060及紫杉醇干预裸鼠荷瘤模型,能有效缩小成瘤体积、减轻肿瘤质量。3 INCB28060抑制c-Met及下游通路PI3K/AKt,抑制细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡。结论1上皮性卵巢癌组织c-Met基因表达上调,c-Met蛋白呈高表达。2 INCB28060可通过抑制c-Met的表达调控下游通路PI3K/AKT,p-c-Met、p-PI3k、p-AKT的表达量均下降,可通过调控c-Met及下游通路mTOR、Mdm2、p53、γH2AX自磷酸化的表达,干扰卵巢癌细胞株的增殖、存活、促进凋亡、调控细胞周期,可能提高对紫杉醇化疗药物的敏感性。3应用INCB28060能够降低荷瘤裸鼠肿瘤体积,促进细胞凋亡,同时可能增加对紫杉醇化疗药物的敏感性。4 INCB28060可能是卵巢癌未来潜在的靶点药物,有望为卵巢癌的辅助治疗带来新的前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

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