抗菌肽LL-37的原核表达纯化及对外阴阴道假丝酵母菌病的疗效研究

发布时间：2018-07-31 05:19

【摘要】：目的：通过构建LL-37原核表达载体,优化表达条件,纯化获得具有生物活性的LL-37重组蛋白。通过细胞及动物实验,探讨重组LL-37蛋白对外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)的疗效及作用机制。方法：1)通过基因工程构建LL-37原核表达载体pET-Duet/LL-37。转化入大肠杆菌(Ecoli)M15菌株后,异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。通过调控诱导剂浓度及诱导时间优化诱导条件。经镍离子金属螯合(NI-IDA)亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,BCA法测定纯化蛋白浓度。KB纸片法初步验证纯化蛋白的抗真菌活性。2)分步消化法原代培养人阴道上皮细胞,传至第4代进行实验。将阴道上皮细胞与假丝酵母菌按1：1共培养,构建VVC细胞模型,分对照组和实验组。实验组加入纯化LL-37蛋白进后继续培养,对照组加入等量PBS溶液。分别于12h、24h、48h收集各组上清液。倒置显微镜观察两组不同时间段阴道上皮细胞及假丝酵母菌生长情况,采用葡萄糖消耗法比较两组抑菌效果(以吸光度A值表示)；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组不同时间段IFN-γ、IL-10浓度及IFN-γ/IL-10比值的变化。3)通过定期雌激素皮下注射,构建小鼠VVC模型。将30只雌性昆明小鼠随机分为对照组及实验组。实验组在成模后每天阴道灌入LL-37进行治疗连续5天,对照组以PBS溶液灌洗。5天后取小鼠阴道灌洗液及阴道壁组织,比较两组灌洗液涂片情况及载菌量变化。ELISA检测阴道壁组织匀浆中IL-10、IFN-γ浓度,比较两组IFN-γ/IL-10比值的变化。结果：1)成功构建pET-Duet/LL-37表达载体。重组蛋白主要以包涵体形式表达。优化表达条件：IPTG0.5mmol/1,诱导时间6小时。纯化得到浓度为433.92ug/ml,纯度可达96%的重组蛋白。KB纸片法证实纯化蛋白具有一定的抗真菌活性。2)成功构建VVC细胞模型。随着培养时间延长,对照组可见假丝酵母菌生长旺盛,吸光度呈明显下降趋势。实验组阴道上皮细胞存活情况好于对照组,假丝酵母菌生长明显受到抑制。各时间段吸光度值均高于对照组,差异有统计学意义,并且下降趋势较对照组缓慢。ELISA结果显示,两组IFN-γ、IL-10分泌水平均呈现先升后降的趋势,于24h达高峰。各时间段比较,实验组IFN-γ浓度于24h时明显高于对照组(p0.05),其他时间段则无明显差异。各时间段IL-10浓度均低于对照组,差异有统计学意义,月IFN-γ/IL-10比值均高于对照组,差异明显。同组内各时间段IFN-γ/IL-10比较,无明显差异。3)成功构建VVC小鼠模型。实验组阴道灌洗液涂片中菌丝及孢子含量明显低于对照组。实验组灌洗液载菌量明显低于对照组(p0.05)。ELISA结果显示,实验组IFN-γ浓度较对照组升高(p0.01),IL-10浓度降低(p0.01),IFN-γ/IL-10|比值则明显升高(p0.05)。结论：1)成功构建了LL-37的原核表达载体,并纯化获得具有抗真菌活性的重组蛋白。2)细胞及动物实验均证实,重组LL-37蛋白对VVC具有明显的治疗作用。3)重组蛋白LL-37对VVC的治疗的作用机制可能为：a、抑制假丝酵母菌的粘附作用降低其致病力,并通过直接杀伤作用杀灭病原菌；b、通过影响IFN-γ、IL-10等免疫因子的分泌,调整阴道局部免疫,恢复由VVC引起的TH1/TH2失衡,从而增强阴道局部抗假丝酵母菌感染的能力。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R711.31

【参考文献】