脂肪间充质干细胞治疗大鼠宫腔粘连的疗效评价及机制探讨

发布时间：2018-10-11 17:15

【摘要】：宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUAs)是指在子宫内膜受到创伤后导致的子宫腔部分或全部消失。该病的发生主要是在子宫内膜(基底层)受到机械损伤、感染或子宫畸形矫治术后因严重内膜损伤而难以修复,引起宫腔粘连及部分或全部宫腔的消失。胎盘残留和重复人工流产后发生率近40%。尽管青少年的性开放程度在提高,但相对薄弱的避孕意识及避孕措施不到位使得年轻女性的非意愿妊娠率明显增加,加之无痛技术的推广和普及导致重复的宫腔操作也增多,继而加重内膜的损伤并使IUAs愈演愈烈,当然宫腔镜的广泛应用也使宫腔粘连的发现率明显提高。IUAs可引起月经异常、腹痛、不孕及辅助生殖时受精卵植入困难、反复流产等问题,它已成为严重影响生育年龄女性生殖预后及生活质量的顽症之一,目前尚缺乏行之有效的治疗方法。当前针对IUAs的治疗措施主要为宫腔镜下粘连分离,术后应用激素、放置节育器或其他支撑材料、置入生物胶等手段以防止粘连再形成,但重度IUAs治疗后再复发率仍高达20%~60%。因此,急需探索新的方法以重建和修复IUAs患者的子宫内膜,降低复发率,改善患者妊娠结局及月经状况。生理状态下育龄女性的子宫内膜随着月经周期的变化不断发生增殖、分泌和脱落的循环。那么,正常子宫内膜为什么能够不断完成和重复无瘢痕再生呢?专家们提出了在子宫内膜基底层可能存在干/祖细胞的观点。Chan等首次在人子宫内膜基底层中分离并培养出了上皮细胞和间质细胞两类具有克隆能力的细胞,印证了子宫内膜中存在成体干细胞的假说。随后,也有学者从分别处于生育期、围绝经期和口服避孕药期间女性的子宫内膜中分离出极少量的上皮细胞和间质细胞的集落生成单位,进一步证实了子宫内膜存在干/祖细胞的理论。Taylor HS在骨髓移植受者体中发现了与供者HLA型别相符的由骨髓干细胞分化而来的子宫内膜细胞,证实了子宫内膜细胞可以由非子宫源性的干细胞分化而来,开启了再生医学修复子宫内膜损伤的新篇章。再生医学中关于子宫内膜损伤修复的细胞来源主要集中于骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞或月经血来源的子宫内膜干细胞,但这些干细胞来源数量少或存在伦理争议,或收集程序工艺繁琐,污染概率大,效率差,不能满足治疗需求。而同为成体干细胞的脂肪来源间充质干细胞,因其来源广泛,更易实现自体移植,以最大限度的减少伦理争议及免疫排斥,已成为子宫内膜修复与重建的优势干细胞来源。因此本研究选用自带标记的绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells from green fluorescent protein transgenic rat,GFP-ASCs)作为研究工具,检测GFP-ASCs的增殖及多向分化潜能,随细胞传代的变化检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达及衰减;并通过构建大鼠宫腔粘连模型,将体外培养的GFP-ASCs通过原位移植或复合小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)等方式移植,观察子宫内膜修复的病理形态学变化、容受性改善及GFP-ASCs对修复的影响。也初步探讨了TGF-β1/Smad3通路在宫腔粘连形成和GFP-ASCs修复内膜中的作用机制,期望为IUAs的治疗探索出新的方法和方向。第一部分大鼠GFP-ASCs分离、培养基及鉴定目的:分离、培养GFP-ASCs,检测表面标记物及多向分化潜能,评价GFP表达的稳定性。方法:1在无菌条件下,取绿色荧光转基因SD大鼠腹股沟脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法分离GFP-ASCs,传代、纯化、培养。2流式细胞学检测第3代ASCs表面标记分子的表达情况,如CD29、CD44、CD90、CD105、CD45、CD34。并进行成脂、成骨诱导培养,茜素红及油红O染色鉴定诱导分化情况。3将不同代数的GFP-ASCs进行爬片培养,在融合度约为50%时,用4%多聚甲醛固定,DAPI染核后,荧光显微镜观察荧光标记情况。4利用MTT检测不同浓度和时长GFP-ASCs复合SIS培养的活性变化。结果:1原代培养的GFP-ASCs约24 h可贴壁,呈多角形或小梭形;72 h几乎全部贴壁,呈现长梭形,散在的细胞集落形成;7~9d后融合度达到90%左右,可进行传代,之后根据细胞融合度进行传代,第2代以后细胞形态趋于稳定,呈纤维细胞样漩涡状生长。2流式细胞学检测检测结果:CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD34(±)及CD45(—),其表达率依次为99.99%、97.48%、99.91%、100%、58.05%、0.79%。3原代、第1、2、3代GFP-ASCs在荧光显微镜下可见细胞贴壁、生长状态良好,形态清晰,整个细胞呈绿色荧光,以细胞核最为明显,轮廓清楚,随着传代次数的增加未见荧光衰减,绿色荧光阳性表达率近100%。4定向诱导分化结果:成脂培养基诱导培养,可见细胞形态变化,油红O染色,可见圆形油滴形成;成骨诱导后可见矿化结节沉积,茜素红染色呈红色。5 GFP-ASCs与SIS复合时,整个检测过程高浓度组中细胞活性始终高于低浓度组,两组变化趋势基本相同,于复合24 h时最高,之后下降,于第4 d后开始上升。结论:GFP-ASCs具有良好的增殖和多向分化能力,在传代过程中绿色荧光表达稳定无衰减,可作为干细胞移植的种子细胞,观察移植效果和细胞示踪定位。可选择高浓度GFP-ASCs、复合SIS 24 h作为后续实验干细胞移植的标准。第二部分大鼠宫腔粘连模型的构建与稳定性评价目的:构建与临床IUAs病理变化相近,稳定性高的大鼠IUAs模型。方法:1采用阴道涂片法确定大鼠动情周期,选择(220~250)g动情期SD大鼠48只备用。将实验动物随机分为三组:(1)双重损伤组:利用微型刮匙搔刮两侧宫角,并放置一根浸泡过LPS的棉线,48 h后撤出;(2)化学损伤组:将苯酚胶浆剂0.03 ml,注射到双侧宫角;(3)正常对照组。2在术后不同时间点:2 d、7 d、14 d、21 d,每组处死4只,进行HE和Masson染色,观察子宫内膜的厚度、腺体数量及纤维化面积,综合评价宫腔粘连情况。3利用免疫组织化学法检测角蛋白的表达。结果:1子宫内膜HE染色随时间的变化:(1)双重损伤组:建模后2 d,可见子宫内膜上皮线的完整性被破坏,宫腔内组织脱落碎片,大量纤维素渗出,炎细胞浸润,间质水肿,胶原纤维稍增多;7 d后,宫腔内可见粘连带,宫腔缩小,未闭锁部分覆盖扁平或低柱状上皮,间质腺体数量减少,纤维化面积较对照组明显增加,纤维化增生,间质区少见少量毛细血管;建模14 d和21 d,与第7 d镜下表现相似,纤维化更加明显,宫腔粘连带增多,宫腔缩小。(2)化学损伤组:在苯酚胶浆剂注入宫角时,宫角因受化学试剂烧灼变成白色。损伤后2 d可见细胞核消失,细胞破裂失去正常形态,内膜层被灼伤坏死,腺体减少,尚未脱落,在被内膜层与肌层交界处可见大量炎性细胞浸润;7 d时,可见纤维增生粘连带的形成,未被粘连覆盖的部位有上皮细胞覆盖,有少许腺体新生,间质稀疏;14 d和21 d时,宫腔稍恢复,柱状上皮细胞覆盖内膜腔,间质腺体增多,无炎症细胞浸润。2建模后病理形态学指标评价:(1)两组的子宫内膜腺体数量在造模后的2 d,7 d和14 d时均明显小于正常对照组(P0.05),但在21 d时,双重损伤组依旧小于正常对照组(P0.05),化学损伤组与正常组无差异(P0.05);(2)两组子宫内膜厚度在造模后2 d,14 d和21 d时,均小于正常组(P0.05);(3)双重损伤组的内膜纤维化面积比在7 d,14 d和21 d时均高于正常组(P0.05),但化学损伤组与正常组的纤维化面积差异无统计学意义(P0.05)。3两组的子宫AE1/AE3表达量在造模后的2 d,7 d和14 d时均明显小于正常对照组(P0.05),但在21 d时,双重损伤组依旧小于正常对照组(P0.05),化学损伤组与正常组无差异(P0.05)。结论:苯酚胶浆剂的化学损伤和双重损伤均能引起子宫内膜损伤,形成宫腔粘连。机械与感染双重损伤构建的模型更加稳定,成为后续干细胞治疗的最佳动物模型选择。第三部分GFP-ASCs不同移植方式治疗IUAs的疗效评价目的:探索SIS作为宫腔粘连隔离材料的可行性,ASC-GFP原位注射或复合SIS移植对宫腔粘连的疗效评价。方法:1选择更加稳定的刮宫和感染双重损伤法建立双侧宫角损伤的宫腔粘连模型,在建模1周后给予不同治疗方案。2治疗方案分组:1)模型组:治疗时仅给予开关腹手术,不进行任何操作;2)Gel组:每侧宫角给予0.3 ml自交联透明质酸钠凝胶(塞纳斯,常州百瑞吉生物药有限公司)宫腔内注射隔离;3)ASCs组:每侧宫角给予1×106个GFP-ASCs沿纵轴肌壁间注射;4)SIS组:SIS联合模具置入双侧宫角腔内;5)ASCs+SIS组:1×106个GFP-ASCs复合SIS分别移植入双侧宫角内。在给予治疗后7 d,14 d,21 d收集子宫标本。3收集的子宫标本用于以下检测:1)通过HE染色观察子宫内膜形态改变,并记录腺体数量,测量子宫内膜厚度。Masson染色观察子宫内膜纤维化情况,利用IPP软件记录纤维化面积百分比。2)提取子宫组织m RNA,q RT-PCR检测容受性相关因子LIF、HOXA10,发病机制相关因子TGF-β1、Smad3的基因水平的表达。3)提取子宫组织全蛋白,western blot检测TGF-β1、Smad3在蛋白水平的表达。4)利用免疫组化检测上皮角蛋白(AE1/AE3)、雌激素受体α(ER-α)的表达及位置情况。5)子宫组织冰冻切片荧光显微镜下观察GFP-ASCs的定位。4以模型鼠双侧宫角一侧宫角给予以上治疗,另外一侧作为自身对照,每组3只大鼠,治疗后2个月,与雄鼠配对,以单侧子宫角的受孕胚胎个数评价内膜功能。结果:1病理形态学相关指标的变化:1)模型组中形态学变化与第二部分中变化一致,四个治疗组的子宫内膜形态均有不同程度的恢复,其中以Gel组和ASCs+SIS组改善最为明显,ASCs组的改善最微弱。Masson染色显示:模型组在第7 d,14 d和21 d时均可见宫腔闭锁及粘连带的形成,较多的蓝色胶原纤维沉积,比较杂乱,排列无规律。Gel组、SIS组和ASCs+SIS组胶原纤维相对颜色较浅,且随着治疗时间延长而变浅,排列较规律。ASCs组胶原纤维沉积较严重,排列略杂乱。2)子宫内膜腺体数量:7 d时,各组无差异(P0.05),14 d时,Gel组和ASCs+SIS组的腺体数量明显多于模型组(3.75 vs 2.75,P=0.019;3.94vs 2.75,P=0.009),且ASCs+SIS组优于ASC组s和SIS组(3.94 vs 2.93,P=0.019;3.94 vs 2.44,P=0.001);21 d时,Gel组和ASCs+SIS组的腺体数量明显多于模型组(5.56 vs 2.62,P=0.000;4.21 vs 2.62,P=0.033);3)子宫内膜厚度:7 d时,ASCs组和ASCs+SIS组均大于模型组(636.06μm vs 419.88μm,P=0.000;457.47μm vs 419.88μm,P=0.018),且大于Gel组(636.06μm vs 396.62μm,P=0.000;457.47μm vs 396.62μm,P=0.006);14 d时,ASCs组和ASCs+SIS组均大于模型组(528.98μm vs315.92μm,P=0.008;498.33μm vs 315.92μm,P=0.022)21 d时,四个治疗组的内膜厚度均厚于模型组(561.98μm vs 319.02μm,P=0.009;776.22μm vs 319.02μm,P=0.000;590.11μm vs 319.02μm,P=0.004;538.03μm vs319.02μm,P=0.018)。4)子宫内膜纤维化面积比:7 d时,SIS组的纤维化面积百分比最小(14.50%),其余几组间无差异;14 d时,Gel组,SIS组和ASCs+SIS组纤维化程度均低于模型组(16.33%vs 30.44%,P=0.000;29.40%vs 30.44%,P=0.002;16.18%vs 30.44%,P=0.000);21 d时,SIS组和ASCs+SIS组纤维化程度均低于模型组(12.00%vs 20.08%,P=0.000;11.28%vs 20.08%,P=0.002)。2 TGF-β1、Smad3和LIF、Hoxa10 m RNA表达变化1)TGF-β1 m RNA变化:在7 d时,Gel组和SIS组的TGF-β1表达低于模型组(0.55-fold vs 1-fold,P=0.039;0.42-fold vs 1-fold,P=0.010);14 d时,Gel组和ASCs+SIS组的TGF-β1表达低于模型组(0.49-fold vs 1-fold,P=0.001;0.48-fold vs 1-fold,P=0.001);21 d时各组之间的TGF-β1水平无差异。2)Smad3 m RNA变化:仅在14 d时五组整体差异有意义,ASCs+SIS组Smad3的表达低于模型组(0.73-fold vs 1-fold,P=0.033);在7 d和21 d时,各组间无统计学差异(P0.05)。3)Hoxa10 m RNA变化:7 d时,各组间Hoxa10 m RNA无统计学差异(P0.05);14 d时,Gel组、SIS组及ASCs+SIS组的Hoxa10 m RNA相对表达量明显高于模型组(4.17-fold vs 1-fold,P=0.020;4.84-fold vs 1-fold,P=0.006;4.02-fold vs 1-fold,P=0.026);21 d时,Gel组和ASCs+SIS组的Hoxa10 m RNA相对表达量明显高于模型组(4.47-fold vs 1-fold,P=0.031;5.61-fold vs 1-fold,P=0.005);各治疗组间相互比较,ASCs+SIS组的Hoxa10m RNA相对表达量明显高于ASCs组(5.61-fold vs 1.64-fold,P=0.015).4)LIF m RNA变化:7 d时,各组间LIF m RNA无统计学差异;14 d时,ASCs组和ASCs+SIS组的LIF m RNA相对表达量明显高于模型组(1.76-fold vs 1-fold,P=0.002;2.46-fold vs 1-fold,P=0.000);21 d时,ASCs+SIS组的LIF m RNA相对表达量明显高于模型组(2.21-fold vs 1-fold,P=0.027)。3 Western blot结果1)TGF-β1蛋白水平的表达:在治疗后7 d时,Gel组、SIS组和ASCs+SIS组TGF-β1的表达低于模型组和ASCs组;在14 d时,四个治疗组的表达量均降低,略少于模型组;第21 d,五组的TGF-β1表达量均降低,表达量相似。2)Smad3蛋白水平的表达:在治疗后7 d时,SIS组和ASCs+SIS组Smad3的表达低于模型组,Gel组和ASCs组的Smad3表达量相当;在14 d时,Gel组和SIS组Smad3表达量降低,低于模型组;第21 d,四个治疗组和模型组的Smad3表达量相似,达到一个稳定阶段。4免疫组化结果1)AE1/AE3蛋白表达量:7 d时,Gel组和SIS组AE1/AE3的表达量明显高于模型组(P=0.011;P=0.000);14 d时,Gel组和SIS组AE1/AE3的表达量依旧明显高于模型组(P=0.001;P=0.049)。21 d时,Gel组,SIS组和ASCs+SIS组的AE1/AE3表达量依旧明显高于模型组(P=0.002;P=0.000;P=0.008)。2)ER-α蛋白表达量:7 d时,Gel组和SIS组ER-α的表达量明显高于模型组(P=0.004;P=0.000);14 d时,Gel组和ER-α的表达量依旧明显高于模型组(P=0.004);21 d时,Gel组,SIS组和ASCs+SIS组的AE1/AE3表达量依旧明显高于模型组(P=0.001;P=0.001;P=0.000)。5免疫荧光显微镜观察子宫组织的冰冻切片发现在ASCs组和ASCs+SIS组移植后21 d内均可见到GFP-ASCs存在于子宫内膜间质内,且ASCs+SIS组中GFP-ASCs随着观察时间的延长而减少,并未发现移植的干细胞出现在上皮及腺体位置。6各组子宫角妊娠结果模型侧的宫角胚胎数较少(0~3只),Gel组治疗侧宫角胚胎数增多(6~9只),ASCs组治疗侧宫角胚胎着床数增加不明显(2~5只),SIS组治疗侧宫角胚胎着床数增多(4~6只),ASCs+SIS组治疗侧宫角胚胎着床数增多明显,与Gel组治疗相似(7~9只)结论:1医用自交联透明质酸可以有效预防IUAs的粘连再形成,有助于改善内膜的形态,并提高早期内膜容受性,改善妊娠情况。2 ASCs原位肌层间注射移植,不能明显改善子宫内膜情况。3 SIS复合或不复合ASCs移植后,均可明显改善子宫内膜病理形态学指标,减少纤维化,促进内膜生长,提高内膜容受性,改善妊娠情况。以SIS复合ASCs效果更加突出。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.74

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