Hedgehog信号调控人胎盘滋养细胞甾体激素合成和合体化

发布时间：2018-10-18 19:12

【摘要】：研究背景与方法胎盘是胚胎发育中最早形成的临时性器官,又是妊娠时期最重要的内分泌器官,一旦胎盘分泌激素不足或者紊乱,将会导致胎儿和母体的各种疾病。在胎盘合成的所有甾体激素中,孕酮(P4)和雌二醇(E2)是最重要的。胎盘的基本结构和功能单位是胎盘绒毛膜绒毛,它主要由合体滋养层、细胞滋养层、绒毛膜间质和胎儿血管内皮组成。合体化是发生于人类胎盘中的一种细胞-细胞融合类型,是指单核的细胞滋养层细胞融合形成多核的合胞体滋养层细胞的过程,是胎盘正常形态学和胎盘功能维持的前提条件;同时,胎盘激素的分泌也和滋养层的合体化密切相关。Hedgehog(H)基因是一种最初在果蝇里发现的分节极性基因。哺乳动物中存在三个 Hedgehog 的同源基因:Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(1HH)和Desert Hedgehog(DHH),分别编码SHH、IHH和DHH蛋白。HH信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched(PTC)和Smoothened(SMO)的控制。正常情况下,PTC抑制SMO蛋白的活性,从而抑制下游通路,这时下游的GLI蛋白在蛋白酶体(Proteasome)内被截断,并以羧基端被截断的形式(GLI-AC)进入细胞核内,抑制下游靶基因的转录;而当PTC和HH结合以后,PTC对SMO的抑制作用被解除,从而使全长的GLI蛋白进入细胞核内激活下游靶基因转录。之前的研究已经发现,HH信号中的关键分子在小鼠的胎盘中显著表达,同时SHH基因的缺失造成小鼠胎盘发育缺陷,导致胎鼠发育障碍,这证实SHH在小鼠胎盘中发挥巨大的作用。然而,HH信号对人胎盘的效应及其分子机制尚未知晓。本课题采用人胎盘组织和人胎盘来源的细胞系,通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色、组织HE染色、体外胎盘滋养层细胞分离与培养、实时荧光定量PCR、WesternBlot、蛋白过表达载体瞬时转染、蛋白质邻位连接试验、蛋白质半衰期测定试验、酶联免疫吸附法、慢病毒介导的的基因敲降、双荧光素酶报告基因检测、细胞融合指数的测定、蛋白质免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀和裸鼠的移植瘤模型等实验技术,研究了 HH信号对人胎盘滋养细胞甾体激素合成和合体化的效应及其分子机制。研究结果1.HH信号中的关键分子在人胎盘组织中均有表达。其中,DHH和IHH均大量表达于绒毛锥和滋养层细胞层,而SHH在绒毛锥和滋养层细胞层的表达量则较低。两个受体蛋白PTC和SMO主要表达于滋养层细胞层,而转录因子GLI2和GLI3则均大量表达于绒毛锥和滋养层细胞层。但是,转录因子GLI1在胎盘中的表达较弱。2.激活HH信号可显著促进人胎盘细胞滋养层细胞(CTB,cytotrophoblast)和JEG-3细胞中胆固醇向孕酮(P4)和雌二醇(E2)等甾体激素的转化;并且,SHH显著地增加参与孕酮、雌二醇合成的三个关键酶P450scc、3P-HSD1和aromatase的mRNA水平和蛋白水平的表达。此外,激活HH信号可显著促进CTB和BeWo细胞的合体化,包括细胞融合指数的增加,融合基因及细胞合体化关键marker(syncytin-1和PP13等)的mRNA和蛋白水平的的升高,以及βHCG分泌量的增加。3.HH对甾体激素的合成及合体化的调控依赖受体蛋白SMO。抑制剂cyclopamine 剂量依赖地逆转 SHH 诱导的 P450scc,3β-HSD1 和 aromatase 的mRNA和蛋白表达,同时显著地抑制了 SHH诱导的P4和E2的合成;相反地,过表达SMO*(SMO氨基酸突变体,SMO的连续激活形式)可显著上调P450scc,3β-HSD1和aromatase的 mRNA和蛋白表达并显著促进P4和E2的合成。此外,激动剂purmorphamine或SMO*均能够显著地抑制ZO-1的mRNA和蛋白水平的表达,而促进PHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表达;相反地,抑制剂cyclopamine显著增加了 ZO-1的表达,而抑制了 syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表达,以及βHCG的合成。4.转录因子家族GLI蛋白在调控人胎盘滋养细胞甾体激素合成和合体化中发挥着不同的作用。在甾体激素合成中,GLI3调控P450scc的转录,而GLI2则影响3β-HSD1和aromatase的转录。与这几个酶的变化相一致,GLI2和GLI3调控P4的合成,而GLI2则调控E2的合成。在合体化中,GLI2对于HH调控的合体化是必需的。GLI2能够调控ZO-1的mRNA和蛋白水平的表达,βHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表达。前人的研究表明,GCMa在调控滋养层细胞合体化中发挥着不可或缺的作用;并且许多细胞融合基因(如syncytin-1)为GCMa的靶基因,GCMa可以通过促进融合基因的表达进一步促进合体化。我们发现,GLI2能够与GCMa形成复合体从而显著影响GCMa蛋白的稳定性和转录活性;此外,转录复合体GLI2-GCMa对于滋养层细胞的合体化是必需的。5.发现GLI新的靶基因。双荧光素酶报道基因实验证实GLI2显著地促进3β-HSD1、aromatase和syncytin-1的启动子报道基因的活性,过表达△N-GLI3能够显著地促进P4500scc启动子报道基因的活性。染色质免疫共沉淀-PCR实验进一步证实,GLI2能够与3β-HSD1、aromatase和syncytin-1基因的启动子结合,而GLI3则能够与P450scc的启动子结合。6.裸鼠移植瘤模型中的结果。为了进一步明确HH调控的P4和E2的生理作用,我们在卵巢切除的裸鼠中植入了人胎盘滋养层绒毛膜癌细胞JEG-3来源的移植瘤,同时cyclopamine给药。结果表明,移植了 JEG-3瘤的卵巢切除裸鼠子宫增大,子宫上皮平坦但明显增厚,子宫内膜腺体以及蜕膜了的基质细胞增多,提示子宫的蜕膜化程度较高。低剂量的cyclopamine和高剂量的cyclopamine均不影响肿瘤的体积和重量,也没有显著影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。但是,cyclopamine剂量依赖地显著抑制了小鼠血清中P4和E2水平,同时,cyclopamine显著降低了子宫湿重,抑制了子宫上皮的增厚,减少了基质细胞的数量以及子宫内膜腺体的数量。因此,以上结果证实,HH信号的抑制引起了 P4和E2的合成减少,导致子宫蜕膜化显著减弱。结论我们的研究结果表明,在人胎盘组织中,HH信号通路的关键分子均有表达。HH通过不同的GLI转录因子调控妊娠时期的不同事件:GLI2和GLI3分别通过促进甾体激素合成酶3β-HSD1和aromatase,以及P450scc的转录从而诱导胆固醇向雌二醇、孕酮的转变。此外,在滋养层细胞的合体化过程中,GLI2通过与转录因子GCMa结合形成转录异源二聚体,从而增强了 GCMa的蛋白稳定性与活性,同时转录复合体GLI2-GCMa通过促进融合基因syncytin-1等的转录进一步促进细胞滋养层细胞的合体化。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.5

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