人废弃胚胎来源的胚胎干细胞建系研究

发布时间：2018-10-23 16:40

【摘要】：目的人胚胎干细胞起源于囊胚内细胞团，具有无限自我更新及体内外分化成人体任何一种细胞类型的能力，胚胎干细胞全能性特征可为细胞替代治疗及药物筛选提供大量资源。人胚胎干细胞系1998年就已建立，但是胚胎干细胞系的发育潜能和表观遗传特性存在很大差异，导致用于人体移植治疗时会出现HLA免疫排斥问题。国内干细胞株数远不能满足HLA匹配数，还需要建大量不同胚胎来源的干细胞株。在大部分IVF胚胎室，受精卵通常培养至第3天（D3），所有胚胎经形态学评分后，高评分胚胎用于移植或冷冻，低评分胚胎由于发育潜能不足，序贯培养获得囊胚着床率低、死亡率及染色体异常率高，通常予以丢弃。尽管形态学评分目前是大多数生殖中心的胚胎判断标准，但并不是胚胎发育潜能的金标准。本研究收集D3低质量废弃胚胎，序贯培养至D6，囊胚扩张后（3级及以上）行玻璃化冷冻，冻融后培养至D8或D9接种，本研究在常规建系方法基础上进行了改进，尝试用D6天低质量冻融囊胚进行干细胞建系，为人废弃胚胎干细胞建系提供材料和方法学参考。方法（1）囊胚序贯培养、冷冻：本实验开始前已获得安徽医科大学伦理委员会的同意，，并且所有提供废弃胚胎的夫妇均已签署知情同意书，同意其废弃胚胎用于科研。收集本中心D3废弃胚胎行序贯培养，获得的囊胚玻璃化冷冻储存。（2）胚胎解冻、培养：胚胎解冻后序贯培养至D8或D9，观察囊胚形态变化，对含有内细胞团的存活囊胚进行接种。（3）接种、传代：接种之前链蛋白酶消化去除透明带，机械打孔成功后接种，待原代集落长出后，将原代集落接种至事先准备好的小鼠饲养层上，7天传代一次。（4）胚胎干细胞特征鉴定：分别取不同代次的胚胎干细胞行碱性磷酸酶染色，干细胞体内外分化，免疫组化荧光染色以及染色体核型分析。结果（1）囊胚形成率：共收集168枚低形态学评分的D3废弃胚胎，参照SteerCV的评分标准，所有胚胎的单胚胎评分均小于16分。序贯培养至D6天共获得低质量囊胚（包括3CB,3BC,4CB,4CC）32枚，复苏后存活26枚，囊胚形成率19.0%，复苏存活率81.3%。（2）复苏、接种后生长状况：复苏后存活的囊胚26枚，均含有不同形状大小的内细胞团，分离出原代克隆8个，其中2个在传代过程中分化，其余2个原代克隆准备传第2代时出现污染。我们从一个4CB及3BC的囊胚成功分离培养出hESC，其中1株已传36代，另一株已传20代。（3）hESC的生物学特性分析：传代过程中的干细胞集落表现出典型的干细胞克隆特征，细胞间连结紧密，与周围饲养层细胞形成明显的界限；碱性磷酸酶AKP染色强阳性；间接免疫荧光着色，干细胞集落高表达OCT-4抗体；完整干细胞集落免疫表型分析显示细胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表达阳性。D26，D36染色体核型分析均为正常二倍体核型，46XX。干细胞集落接种到SCID小鼠腹股沟皮下，10周后形成的畸胎瘤可见3个胚层的细胞，包括角化复层扁平上皮（外胚层）、软骨（中胚层）以及肠腺上皮（内胚层）；胚胎干细胞克隆集落体外悬浮培养14天后形成拟胚体状结构。结论临床上D3低质量胚胎经囊胚序贯培养可以形成囊胚；低质量冷冻囊胚经复苏培养接种后可以形成胚胎干细胞原代集落；低质量冷冻来源的胚胎干细胞原代集落可以成功接种传代并保持经典胚胎干细胞特性；临床上低质量废弃胚胎可以成功序贯培养出囊胚并进行胚胎干细胞建系研究。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8

【共引文献】