长链非编码RNA-ElncRNA1在ERα阳性卵巢癌转移中功能及机制的研究

发布时间：2018-11-10 09:22

【摘要】：卵巢癌病死率高、预后差。卵巢癌转移是影响预后的关键,目前卵巢癌转移的机制尚未明了。在众多研究中,越来越多的流行病学资料和实验肯定了雌激素(estrogen, E2)在卵巢癌增殖、转移中的作用,认为,E2促进卵巢癌增殖、转移的作用主要通过E2诱导的靶基因实现。已有的研究及本课题组前期工作已经识别了一系列E2诱导的蛋白编码基因并获得了丰富研究成果,然而卵巢癌转移过程中E2诱导的靶基因绝不仅仅局限于蛋白编码基因。长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是最近备受瞩目的哺乳动物转录组重要成员,相关研究虽刚刚起步,但已有的研究已表明IncRNA失调是多种癌症的特征之一。IncRNA的发现为研究恶性肿瘤的生物学行为提供了重要契机。然而,在卵巢癌研究领域,IncRNA的报道不多,卵巢癌转移过程中E2诱导的IncRNA的功能分析及机制探索更是个空白。有鉴于此,本课题中,我们借助ERa阳性(ERa+)卵巢癌细胞,明确E2是否能诱导IncRNA表达谱的变化,并围绕某个E2诱导的IncRNA作深入研究,分析其表达变化与ERa阳性卵巢癌临床病理因素及预后的关系。在此基础上,通过体内外实验探讨其表达变化是否能影响ERa阳性卵巢癌恶性生物学行为并探索其中的分子机制,本课题一方面将从IncRNA视角对雌激素与卵巢癌转移研究网络作一个重要补充,另一方面将为ERa+卵巢癌转移机制及治疗提供新思路和靶向,也为ERa+卵巢癌的预后提供新的潜在标志物。第一部分雌激素诱导ERa阳性卵巢癌细胞中长链非编码RNA-EIncRNA1的筛查验证目的在ERa+卵巢癌细胞中,筛选E2诱导的IncRNAs;初步探讨兴趣IncRNA受E2调控的机制。方法 (1)利用IncRNA芯片比较E2刺激组与E2未刺激组ERa+卵巢癌细胞中IncRNA表达谱的变化；(2)通过生物信息学ERE位点预测,分析其中可能受经典ERa-ERE途径调控的IncRNAs;(3)从中挑选出兴趣IncRNA,通过一系列实验(ERa抑制剂、ERa干扰、ChIP实验及双荧光素酶报告基因实验)证实E2诱导兴趣lncRNA的表达是经典ERa-ERE途径依赖的。结果 (1)高通量IncRNA芯片比较发现：在ERa+卵巢癌细胞SKOV3中,E2刺激组与E2未刺激组相比有115个差异表达的IncRNAs(fold change≥1.5,P0.05)。(2)生物信息学ERE位点预测结果显示：19个IncRNAs的启动子区域含有ERE保守序列,预测E2诱导这19个IncRNAs的表达可能是经典ERa-ERE途径依赖的。其中,lncRNA-TC0101441受E2诱导上调的倍数最为显著,被视为兴趣分子,命名为Estrogen-induced long non-coding RNA-1 (ElncRNA1)。 (3)应用ERa抑制剂ICI 182,780及ERa干扰小RNA (ERa-siRNA)均能显著抑制E2诱导ElncRNA1的表达,证实E2上调ElncRNA1的表达是ERa依赖的;ChIP实验结果显示：ERa能特异性结合到ElncRNA1启动子区域,E2刺激使两者的结合增强；将野生型及突变型ERE质粒与ERa过表达质粒及空载体共转染SKOV3细胞,双荧光素酶报告基因实验结果显示：过表达ERa后,ElncRNA1启动子野生型ERE的活性明显升高,在E2存在的情况下升高更明显。另外,在有无雌激素时,ERE突变均降低了ERa诱导的ElncRNA1启动子活性,证实E2上调ElncRNA1的表达是经典ERa-ERE途径依赖的。结论我们首次发现在ERα+卵巢癌细胞SKOV3中,E2能诱导IncRNAs表达谱的改变。同时,我们原创性地鉴定了一个E2诱导的新IncRNA-ElncRNA1,证实E2上调ElncRNA1的表达是经典ERa-ERE途径依赖的。第二部分ElncRNA1在ERa阳性卵巢癌组织中的表达及临床意义目的 研究ElncRNA1在ERa+卵巢癌组织中的表达水平,分析ElncRNA1异常表达与ERa+卵巢癌临床病理因素及预后之间的关系。方法 (1)收集上皮性卵巢癌组织96例,免疫组化检测卵巢癌组织中ERa的表达情况。(2)实时定量PCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测ERa+、ERa阴性(ERa-)及20例正常卵巢上皮组织中ElncRNA1的表达水平。(3)应用统计学方法分析ElncRNA1异常表达与ERa+卵巢癌临床病理因素、总生存期(Overall Survival, OS)及无进展生存期(Progression-free Survival, PFS)的关系。结果 (1)免疫组化结果显示：96例卵巢癌组织中,ERa+卵巢癌组织74例,ERa-卵巢癌组织22例。(2)qRT-PCR结果显示：ElncRNA1在ERa+卵巢癌组织中的表达明显高于ERa-卵巢癌组织及正常卵巢上皮组织。(3)临床病理因素分析显示：ElncRNA1的高表达与FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、组织学分级(G3)、淋巴结转移显著相关(P0.01),与年龄、病理类型、术后残余留直径、CA125、腹水无相关性。(4)生存分析显示：ElncRNA1的高表达与OS和PFS显著相关(P0.01)；进一步的多因素Cox风险模型分析证实了EncRNA1的高表达在OS和PFS上是ERα+卵巢癌的独立预后因素(P0.05)。结论ElncRNAl的高表达与ERα+卵巢癌的恶性生物学特征,包括FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、组织学分级(G3)、淋巴结转移密切相关；ElncRNA1是ERα+卵巢癌患者的独立预后指标。第三部分ElncRNA1在ERα阳性卵巢癌细胞恶性表型中作用的体外实验研究目的探讨ElncRNA1表达变化对ERα+卵巢癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移及侵袭表型的影响。方法 (1)qRT-PCR检测6株ERα+卵巢癌细胞(SKOV3、CAOV3、OVCAR3、 HO8910、PEO1及PEO4)中ElncRNA1的表达水平；从中选择细胞株,采用慢病毒技术构建2株ElncRNA1干扰株及1株过表达株。(2)采用CCK-8实验评估干扰/过表达ElncRNA1对ERα+卵巢癌细胞增殖表型的影响。(3)利用流式细胞仪分析干扰/过表达ElncRNA1对ERα+卵巢癌细胞凋亡表型及细胞周期的影响。(4)使用细胞划痕法及Transwell侵袭实验评估干扰/过表达ElncRNA1对ERα+卵巢癌细胞迁移及侵袭表型的影响。结果 (1)qRT-PCR结果显示：在6株ERα+卵巢癌细胞中,SKOV3及CAOV3细胞中ElncRNA1的表达较高,构建了ElncRNA1慢病毒干扰株；HO8910细胞中ElncRNA1的表达最低,构建了ElncRNA1慢病毒过表达株。(2)CCK-8增殖实验结果显示：与对照组相比,干扰ElncRNA1的SKOV3和CAOV3细胞增殖能力降低,过表达ElncRNA1的HO8910细胞增殖能力增强,差异有统计学意义。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的结果显示：干扰ElncRNA1的SKOV3和CAOV3细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均升高,但细胞周期未见明显改变；过表达ElncRNA1的HO8910细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均未见明显改变,但进入S期细胞的比例升高,阻滞在G0～G1期细胞的比例相对下降,与对照组相比差异有统计学意义。(4)细胞迁移实验结果显示：48h后,干扰ElncRNA1的SKOV3和CAOV3细胞的迁移能力明显弱于对照组；24h后,过表达ElncRNA1的HO8910细胞的迁移能力明显强于对照组。Transwell侵袭实验结果显示：干扰ElncRNA1的SKOV3和CAOV3细胞穿过小室基底膜的细胞数量较对照组明显降低。而过表达ElncRNA1的H08910细胞穿过基底膜的细胞数量较对照组明显增加。结论在细胞增殖、凋亡、周期、迁移及侵袭恶性表型中,干扰和过表达ElncRNA1对ERa阳性卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响最为显著,提示ElncRNA1在ERa阳性卵巢癌细胞迁移侵袭中扮演着重要角色。第四部分干扰ElncRNA1对ERa阳性卵巢癌腹腔种植瘤播散转移影响的体内实验研究目的构建裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型,探讨干扰ElncRNA1在体内对肿瘤转移的影响。方法体外培养干扰ElncRNA1、并携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的慢病毒SKOV3细胞及对照SKOV3细胞,利用最佳筛选浓度嘌呤霉素溶液进行筛选,获得干扰ElncRNA1的SKOV3稳转细胞株(LV-ElncRNA1-shRNA-SKOV3)及对照稳转细胞株(LV-NC-SKOV3)。腹腔注射LV-ElncRNA 1-shRNA-SKOV3细胞及LV-NC-SKOV3细胞,构建裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型,分为实验组及对照组。腹腔注射肿瘤细胞后,每周进行活体成像一次,动态监测两组裸鼠腹腔内种植瘤播散的变化。腹腔注射肿瘤细胞4周后处死裸鼠,观察两组裸鼠腹腔种植瘤播散转移情况,比较两组种植瘤的数目及重量。结果腹腔注射肿瘤细胞4周后,活体成像结果显示：对照组可见大面积的种植瘤腹腔播散转移结点灶,而干扰ElncRNA1后,裸鼠种植瘤腹腔播散转移结点灶显著减少。处死所有裸鼠,打开腹腔发现：对照组裸鼠的种植瘤个数多,腹腔播散广泛,肠曲间、肝脏均有种植瘤生长；然而,干扰ElncRNA1组裸鼠的种植瘤个数少、腹腔播散局限,肠曲间及肝脏仅少量或无种植瘤生长。将各组裸鼠腹腔种植瘤剥离后计数,发现干扰ElncRNA1组种植瘤数目(9.33±1.86)较对照组(51.33±4.59)显著减少,差异有统计学意义(P0.05)；同时,将剥离后瘤体称重,发现干扰ElncRNA1组种植瘤重量(0.15土0.01 g)较对照组(0.81±0.05 g)减少5.4倍,差异有统计学意义(P0.05)。结论 干扰ElncRNA1显著抑制裸鼠腹腔种植瘤的播散转移,表明在体内,ElncRNA1能促进ERa阳性卵巢癌的转移。第五部分ElncRNA1促进ERα阳性卵巢癌转移相关机制的初步探索目的初步探索ElncRNA1促进ERα阳性卵巢癌转移的分子机制。方法在干扰ElncRNA1的SKOV3稳转株及对照株中,利用肿瘤转移基因PCR芯片筛选差异表达的肿瘤转移基因；利用qRT-PCR在过表达ElncRNA1的H08910细胞株及对照株中进一步验证差异基因的表达,以探寻ElncRNA1促ERα阳性卵巢癌细胞转移的下游调控分子。从中找寻线索,利用western blot、免疫组化、siRNA干扰等实验初步探索其中的分子机制。结果(1)转移基因PCR芯片结果显示：与对照相比,在干扰ElncRNA1的SKOV3稳转株中筛选出差异表达(fold change≥ 5)的基因共1 0个。(2)qRT-PCR进一步检测过表达ElncRNAl的H08910细胞及对照株中上述10个肿瘤转移基因mRNA的表达改变,结果显示：过表达ElncRNA1引起5个转移基因的表达改变与敲除ElncRNA1引起的表达改变相一致。其中,绝大多数基因为EMT相关基因,被视为ElncRNA1可能调控EMT的重要线索。(3)Western blot检测EMT标志性分子,结果显示：与对照相比,干扰ElncRNA1的稳转SKOV3细胞高表达上皮性标志分子E-cadherin,低表达间质性标志分子FN-1及N-cadherin;免疫组化检测体内裸鼠腹腔转移瘤组织中E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表达,结果显示：干扰ElncRNA1组的E-cadherin表达较高,而FN-1及N-cadherin表达降低。 (4)qRT-PCR检测转录因子Snail、Slug、Twist的表达改变,结果显示：干扰／过表达ElncRNA1后,Snail的表达改变最为显著；western blot及裸鼠腹腔转移瘤组织的免疫组化结果进一步证实：干扰ElncRNA1显著降低Snail的表达。(5)在过表达ElncRNA1的H08910细胞中应用Snail-siRNA能显著抑制ElncRNA1对E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表达改变,说明ElncRNA1通过Snail影响了EMT标志分子的表达,为ElncRNA1通过Snail影响EMT进程提供了依据。结论ElncRNA1通过Snail促进ERa阳性卵巢癌细胞发生EMT,进而赋予ERa阳性卵巢癌细胞转移的恶性表型。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

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1 邱君君;长链非编码RNA-ElncRNA1在ERα阳性卵巢癌转移中功能及机制的研究[D];复旦大学;2014年

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本文编号：2322034