RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及意义

发布时间：2018-11-11 13:44

【摘要】：研究背景：血管生成（angiogenesis）在维持卵巢生理功能和卵巢癌的发生发展中有着重要的作用，提示抗肿瘤血管生成在抗肿瘤治疗中具有重要的地位。目前抗VEGF及其受体的药物在卵巢癌已进入临床应用，取得了初期的疗效，但对高级别的肿瘤单纯使用抗VEGF药物难以控制肿瘤的进展，容易引起耐药，甚至引发肿瘤的侵袭和转移。由于肿瘤的血管生成过程是一个有多种因素参与的，多条信号通路调控的，极其复杂的过程，单独使用某种血管生成抑制因子或是阻断与血管生成相关的某一条信号通路并不能完全阻断血管的生成，因而有必要寻找其他种类的靶基因。G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptors，GPCRs)介导的信号通路是细胞信号传递途径中最常见的一种信号传递方式，对机体内各个系统都有着重要的影响。近来研究发现GPCRs与肿瘤的发生发展密切相关，因此对GPCRs通路的调控在肿瘤的病理生理过程具有重要意义。G蛋白信号通路调节蛋白（Regulator of G Protein Signaling，RGS）是一类负性调节G蛋白信号传导通路的蛋白分子，含有30多种蛋白质。其中RGS5是G蛋白信号通路调节蛋白家族中的一员，通过促进G蛋白α亚基的GTP酶活性，负性调控GPCRs信号转导。RGS5高表达于肿瘤新生血管发育成熟的初期,调节血管周细胞的分化与募集，参与血管成熟的调控。RGS5在肿瘤血管内皮细胞（Tumor-derived microvascularendothelial cells, TdMECs）的表达明显高于正常血管内皮细胞，其基因表达上调会明显降低新生血管对于抗VEGF所致的血管退行性变的敏感性，表明RGS5可能是重要的替代贝伐珠单抗耐药性的抗血管生成靶点。研究目的：抗肿瘤血管生成治疗的耐药性源于肿瘤血管的异质性，包括染色体的不稳定性，容易产生耐药株，而了解TdMECs的异质性，寻找特异而有效的靶点，并通过组织来源不同的TdMECs作为药物靶点的研究，可提高肿瘤抗血管生成药物疗效并降低耐药性发生率。RGS5可负性调节与肿瘤的发生发展密切相关的GPCRs信号通路，作为一个最近一两年渐渐受到关注的蛋白，RGS5的作用和调节机制还不清楚，它不仅参与血管周细胞的成熟，在肿瘤血管内皮细胞亦有高表达。目前RGS5在卵巢癌发生发展中的作用尚未见报道，了解RGS5在卵巢癌的表达特点，研究其在卵巢癌血管生成中的作用及机制，将有利于多靶点抗血管生成的治疗策略在卵巢癌的实施和发展。研究方法： 1.回顾性分析87例卵巢癌组织标本，通过连续切片检测RGS5在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达情况，分析RGS5与临床各病理参数、患者生存时间以及微血管密度的关系。 2.在免疫磁珠细胞分选技术获得高纯度卵巢癌微血管内皮细胞的基础上，通过对体外培养的卵巢癌微血管内皮细胞（ovarian carcinoma-derived microvascular endothelialcells, ODMECs）形态、细胞超微结构、体外成管以及生长增值能力的观察，了解ODMECs是否在体外培养中的生物学特性，并检测RGS5的表达情况和特点。 3.通过构建RGS5特异性siRNA慢病毒载体下调RGS5蛋白的表达，了解RGS5参与调控的ODMECs体外生物学效应，并进一步探讨RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及机制。主要结果： 1. RGS5不仅在肿瘤血管周细胞表达，在卵巢癌微血管内皮细胞中的表达与Endoglin标记的血管相重叠，但鲜见于CD34标记的成熟血管，在一些无CD34也无Endoglin表达的管腔样结构中亦偶见RGS5的阳性着色。Endoglin是新生血管的标记物，主要表达于卵巢癌边缘的微血管，其表达水平与上皮性卵巢癌（Epithelial ovariancancer, ECO）血管生成密切相关，提示RGS5可能参与了卵巢癌早期血管生成的调控。 2.第一次阐述了RGS5蛋白在卵巢癌细胞有表达，其表达的高低与卵巢癌患者腹膜转移显著相关，高表达RGS5的患者腹膜转移的发生率明显低于低表达RGS5的患者，预后亦优于后者。此外，RGS5在卵巢癌细胞的表达还与CD34标记的微血管密度（microvascular densities, MVD）呈负相关。 3.与正常内皮细胞多处于静止期不同，ODMECs增生活跃，胞核遗传物质丰富，，高表达促血管生成因子VEGF、TGF-β的受体VEGFR2和Endoglin，体外成管能力增强。RGS5的表达在ODMECs体外管腔样结构形成时降低，并且随细胞培养时间的延长递减，推测可能与离开肿瘤微环境有关，然而与RGS5作用密切相关的VEGF与PDGF-BB对其在体外的表达无明显的刺激作用，说明RGS5在肿瘤组织的表达可能不依赖于或不仅仅依赖于VEGFR和PDGF-β信号通路的调节。 4.缺氧可诱导RGS5在ODMECs表达，通过慢病毒载体携带的RGS5特异性siRNA，实现对原代培养的ODMECs表达RGS5蛋白的高效抑制后发现在缺氧条件下RGS5可抑制ODMECs细胞增殖，使细胞周期停滞于G1期到S期的转化节点。此外RGS5在ODMECs缺氧时还可诱导细胞的凋亡，但不影响细胞的迁移能力。 5.干扰RGS5蛋白的表达可使分裂周期蛋白CDC25A以及与细胞周期密切相关的CDK2蛋白和细胞周期蛋白CyclinE表达增高；MAPK通路中ERK磷酸化明显降低。ERK1/2抑制剂PD98059可影响CDC25A、CDK2及CyclinE蛋白的表达，其负性调节上述蛋白的表达与RGS5有协同效应。进一步研究发现，用PD98059与LV-siRGS5同时处理ODMECs可明显降低细胞的增殖率，提示RGS5可负性调节MAPK/ERK通路介导的CDC25A及下游蛋白CDK2和CyclinE的表达，参与ODMECs细胞周期和细胞增殖的调控。结论：本研究发现RGS5不仅在卵巢癌血管周细胞、在内皮细胞亦有表达，在癌细胞的表达则与腹膜转移和患者预后相关，并且与微血管密度呈负相关。缺氧可诱导RGS5在ODMECs的表达，从而抑制细胞的增殖。因此无论从内皮细胞与血管周细胞的相互作用还是从抗血管生成与抗肿瘤转移在肿瘤中的价值来看，RGS5在卵巢癌中的作用与机制都有不可忽视的研究前景。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】