卵巢癌干细胞样细胞与耐紫杉醇细胞的差异表达蛋白谱特征及其临床意义

发布时间：2018-11-13 16:36

【摘要】：研究背景卵巢癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤之一,也是致死率最高的妇科恶性肿瘤,如何提高卵巢癌生存率仍然是当今的世界性难题。在卵巢癌各种组织学类型中,上皮性卵巢癌最为常见,占90%以上。上皮性卵巢癌缺乏早期症状,75%的患者在初诊时,肿瘤细胞已在腹腔内广泛播散。尽管手术理念的不断更新和手术技巧的不断提高,初次手术通常不能切净晚期患者的全部转移病灶。随着新的化疗药物和方案的不断更新,初次化疗的缓解率不断提高,但大多数晚期病人在完全缓解后2年左右复发,复发性卵巢癌几乎对所有化疗药物耐药。所以,寻找上皮性卵巢癌进展及耐药相关的标志物,对揭示上皮性卵巢癌的发生发展本质,和发现可用于早期诊断和预后预测的标志物及逆转耐药的有效靶点均具有重要的意义。自1948年人类发现第一个肿瘤标志物以来,肿瘤标志物的研究和应用进展迅速。但对上皮性卵巢癌而言,迄今为止发现的各种肿瘤标志物,如CA125、CA199、 CA153、HE4等,对上皮性卵巢癌的诊断、治疗反应评价、预后评估与复发耐药监测及筛查有一定的帮助,但其特异性和敏感性仍然有限。20世纪90年代中期出现了一门新兴学科：蛋白质组学。利用蛋白质组学技术,可以分析不同条件下蛋白质的差异表达,从而研究生命的现象。蛋白质组学技术越来越多地应用于医学研究。许多疾病包括癌症,已被认为是蛋白质组的疾病。蛋白组学为寻找疾病特别是癌症的分子标记物提供了有效方法。随着研究的深入,人们发现在肿瘤组织中存在一群特殊类型的细胞,即肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)。肿瘤干细胞最早于20世纪70年代在血液系统肿瘤中发现。此后,在包括卵巢癌在内的许多实体瘤中都证实了肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞具有自我更新和多潜能分化的能力,在肿瘤发生发展中起着决定性的作用,也是肿瘤转移、复发的根源。更重要的是,肿瘤干细胞对化疗药物天然耐药。现有的化疗药物,杀死的其实是普通肿瘤细胞,而对肿瘤干细胞基本无效。了解肿瘤干细胞的蛋白表达特征,对探索以针对肿瘤干细胞为靶点的治疗新策略具有重要意义。我们在前期研究中,以上皮性卵巢癌细胞系3AO作为研究模型,采用无血清培养基的方法成功分离并鉴定出了卵巢癌肿瘤干细胞样细胞(ovarian cancer stem cell-like cells, OCSC-LCs),发现其高表达公认的干细胞相关基因Notch2, Sox2等,并具有CD24-的细胞表面标记,与此同时,还证实了CD24-细胞对紫杉醇和顺铂均显著耐药。我们前期对卵巢癌干细胞样细胞的成功分离与鉴定,为后续研究打下了坚实的基础。本研究首先利用蛋白质组学技术,以亲本卵巢癌细胞株为对照,分别对卵巢癌干细胞样细胞和卵巢癌耐药细胞筛选差异表达蛋白,并进行信息学分析；然后选择4个显著差异表达的蛋白质,在细胞水平进行western blot验证；最后选取UTP23蛋白,通过免疫组化在组织水平验证UTP23异常表达及其与卵巢癌临床病理特征及预后的相关性。旨在发现可用于上皮性卵巢癌诊断和预后预测的标志物或耐药逆转的靶点,为探索卵巢癌诊治新策略提供新路径。第一部分卵巢癌干细胞样细胞和耐紫杉醇细胞与亲本细胞差异表达蛋白的分离和鉴定目的：分离和鉴定卵巢癌干细胞样细胞和耐紫杉醇细胞与它们的亲本卵巢癌细胞之间的差异表达蛋白,从而寻找与卵巢癌发生发展及耐药可能相关的分子标记物。方法：对上皮性卵巢癌细胞3AO采用无血清培养基悬浮培养获取卵巢癌干细胞样细胞。对上皮性卵巢癌细胞SKOV3采用低剂量紫杉醇持续作用法获取耐紫杉醇卵巢癌细胞(SKOV3-TR30).分别采用非标记定量蛋白质组学分析和DIGE荧光差异凝胶电泳技术筛选卵巢癌干细胞样细胞和耐紫杉醇细胞与亲本细胞间的差异蛋白表达。采用Gene ontology分析进行蛋白功能归类和KEGG法进行信号通路分析。结果： 1.非标记定量蛋白质组学分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR30和非耐药SKOV3细胞中,共鉴定到5016个肽段,558个蛋白质。差异显著的356个蛋白中,上调蛋白47个,下调蛋白309个。 (2)在卵巢癌干细胞样细胞与3AO细胞中,共鉴定到3601个肽段,431个蛋白质,差异显著的187个蛋白中,上调蛋白质72个,下调蛋白质115个。 2. Gene ontology分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR与亲本SKOV3的差异蛋白中,主要涉及代谢(35%)、生物过程调节(24%)、运送(13%)等。 (2)在卵巢癌干细胞样细胞与3AO细胞的差异蛋白中,主要涉及代谢(20%),生物过程调节(12%),细胞成分组织(9%)等。 3. KEGG分析在耐紫杉醇SKOV3-TR与亲本SKOV3细胞和卵巢癌干细胞样细胞与3AO细胞的差异蛋白中,通路的富集程度均没有显著差异。 4. DIGE分析卵巢癌干细胞样细胞与亲本细胞之间存在217个差异表达蛋白,在耐紫杉醇和非耐紫杉醇细胞之间存在225个差异表达蛋白。结论： 1.通过非标记定量蛋白质组学技术检测和荧光差异双向电泳技术检测,分别在卵巢癌干细胞样细胞与亲本细胞之间、耐紫杉醇和非耐紫杉醇细胞之间存在多个差异表达蛋白质。 2.存在于卵巢癌干细胞和耐紫杉醇细胞中的差异表达蛋白,主要涉及细胞代谢、生物过程调节、运送、分化等。第二部分差异表达蛋白的验证目的：选择部分差异表达蛋白,验证蛋白质组学检测的正确性,为下一步的研究打下基础。方法：采用Western blot方法,检测3个下调蛋白质(UTP23、FLNA、HDGFRP3)和1个上调蛋白质(ALDOC)分别在SKOV3/SKOV3-TR30、A2780/AT2780、3AO/3AO-SPH三对卵巢癌细胞株中的表达。结果： 1.UTP23蛋白与SKOV3. A2780、3A0细胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3AO-SPH中表达显著下调,差异有统计学意义(P0.01,p0.001,p0.05),结果与蛋白质组学一致。 2. FLNA蛋白与SKOV3、A2780/3A0细胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3A0-SPH中表达显著下调,差异有统计学意义(P0.005,P0.001,P0.05),结果与蛋白质组学一致。 3. HDGFRP3蛋白与亲本细胞相比,在卵巢癌干细胞样细胞和耐紫杉醇细胞中的表达仅部分结果与蛋白质组学一致。 4. ALDOC蛋白与SKOV3、A2780.3A0细胞相比,在SKOV3-TR30、3AO-SPH中表达显著下调,差异有统计学意义(P0.01,P0.01)；在AT2780中表达下调,无统计学意义(P=0.113),均与蛋白质组学结果不一致。结论： 1.UTP23和FLNA蛋白在卵巢癌干细胞样细胞和耐紫杉醇细胞中低表达,提示两者可作为候选卵巢癌抑癌基因,可能与维持卵巢癌干细胞特征和紫杉醇耐药有关。 2. HDGFRP3和ALDOC表达与蛋白质组学不完全一致,两者在卵巢癌中的作用有待进一步研究。第三部分UTP23在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义目的：通过分析UTP23蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与临床病理参数及预后的关系,以评估UTP23在用于上皮性卵巢癌标记物及药物靶点方面可能的潜在价值。方法：采用免疫组化方法对145例上皮性卵巢癌组织进行UTP23蛋白表达测定,并分析UTP23蛋白表达水平与临床病理参数及预后的关系,包括：年龄、初次手术情况、FIGO分期、病理分级、腹水量、术前血清CA125、化疗反应、无瘤生存期(PFS)及总生存期(OS)。结果： 1.UTP23蛋白表达于上皮性卵巢癌细胞的胞浆中,呈棕黄色颗粒染色。 2.单因素分析显示：UTP23低表达与高FIGO分期、高病理分级、不满意初次手术及CA125水平500U/L显著相关(P0.05)；与化疗敏感者相比,耐药者的UTP23表达更低(P0.05)。 3.单因素分析显示,UTP23表达与患者总生存期(x2=4.548,P=0.033)和无瘤生存期(x2=3.913,P=0.048)显著性相关,表达越低,生存期越短。结论： 1.上皮性卵巢癌细胞表达UTP23,定位于胞浆。 2.化疗耐药者UTP23表达显著低于化疗敏感者,提示UTP23可能参与上皮性卵巢癌化疗耐药。 3.UTP23低表达与上皮性卵巢癌不良预后相关,提示检测UTP23表达可能可用于预测上皮性卵巢癌患者预后。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】