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卵巢早衰患者血浆游离DNA特性及甲基化研究

发布时间:2018-12-14 00:44
【摘要】:卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是原发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)发展的终末阶段,此时原始卵泡池处于耗竭状态,并且此种耗竭状态是不可逆的,临床上表现为闭经、不孕以及骨质疏松、潮热多汗等绝经期症状。POF在临床上并不少见,有调查表明30岁以内女性POF的发病率约为千分之一,40岁以内的发病率约为百分之一。POF的相关病因多且复杂,目前的研究表明,遗传因素、免疫因素、代谢因素、医源性损伤、病毒感染和其他环境因素等都可能导致卵巢早衰的发生。但是,截至目前为止,卵巢早衰的确切的发病机制尚未完全阐明。目前发现多个可能与POF发病有关的基因都与凋亡过程相关。例如MLH3基因突变导致减数分裂不能正常进行,使异常卵母细胞出现了快速凋亡;PGRMC1基因错义突变会损伤卵巢发育中孕酮的抗凋亡作用,使得卵泡的过早丢失,最终导致POF。根据电泳的方法发现细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)与凋亡细胞形成的条带相一致,并且T淋巴细胞等活性细胞DNA的主动释放也会形成相似的条带。由此表明,cfDNA可能主要来源于细胞凋亡和活性细胞新合成DNA的主动释放。因此,我们以cfDNA为切入点探究细胞凋亡是否影响POF的发病。除此之外,DNA甲基化是生物体内一种不可或缺的多种酶参与的表观遗传学调控方式。高等的真核生物可以通过DNA甲基化状态的改变来调控基因是否表达以及表达的程度。研究表明,多种疾病中普遍存在DNA的异常甲基化的现象,尤其是在肿瘤中,这可能是肿瘤的发病中最早出现的改变。cfDNA作为不同于细胞内DNA的遗传物质,有其特有的来源与生物学特性。其中cfDNA甲基化特性可能成为较多相关疾病的诊断靶标。现有的多项研究表明,在多种疾病中cfDNA相关基因的甲基化状态发生改变,并且已经开始探讨将其作为特异性诊断指标应用于临床实践的可能性。故从cfDNA特异基因甲基化角度来探究POF发病机制,对卵巢早衰的早诊断、早治疗以及预后判断有重大的意义。目的通过探究POF患者血浆中cfDNA的含量及完整性的特征以及cfDNA的甲基化的特点,为POF发病机制的研究提供新的角度。方法本研究的研究对象为本中心被诊断为卵巢早衰(POF)的患者,研究样品为患者的血浆细胞游离DNA,以卵巢功能正常的女性为对照。采用实时荧光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)绝对定量法检测细胞游离DNA的含量,通过计算不同片段长度细胞游离DNA的比例得到细胞游离DNA的完整性指数。采用甲基化芯片技术检测血浆cfDNA的甲基化状态,再用GO分析法探索差异甲基化位点对应基因的聚类信息。结果通过Real time-qPCR的方法,用引物ALU115进行Real-time PCR得到的CT值所计算的到的cfDNA浓度,代表血浆中全部的cfDNA含量,引物ALU247进行Real time-qPCR得到的CT值所计算的到的cfDNA浓度,则代表血浆中较大片段的cfDNA含量。通过统计分析发现,POF组的血浆cfDNA浓度高于对照组(9.76ng/μl vs.3.73ng/μl,p0.001),POF组的血浆cfDNA完整性低于对照组(8.35%vs.22.41%,p0.001)。POF组和对照组患者的血清cfDNA经过重亚硫酸盐转化后,用BeadChip Array Inf Methyl 8 Sample Beadchip甲基化芯片对其进行甲基化分析,发现有127724个位点的甲基化水平存在显著差异。POF组和对照组中差异甲基化位点分布在CpG高密度区和CpG中密度区比例分别为39.52%和43.68%。对基因组功能区分析发现,启动子区(TSS1500、TSS200及1st Exon)的差异甲基化位点占36.66%。用DAVID网站对POF组和对照组中差异甲基化位点对应的基因进行GO分析,包括细胞组分、分子功能和生物过程。差异甲基化位点所在基因主要定位于细胞质、质膜、胞质溶胶、胞质外体等细胞组分;具有蛋白结合、ATP结合和RNA结合和GTPase激活剂活性等分子功能;参与正向调节GTPase活性、蛋白磷酸化、细胞内信号转导及正向调节凋亡等生物过程。利用KEGG分析差异甲基化位点所在基因参与的信号通路。结果显示,POF组和对照组相比,差异甲基化位点所在基因主要参与MAPK信号通路、内吞作用以及雌激素信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟及GnRH信号通路等。结论1.卵巢早衰患者血浆中cfDNA的含量增加,而完整性降低,可能是由于细胞凋亡增加所导致的。2.卵巢早衰患者血浆中cfDNA的差异甲基化位点富集于对细胞凋亡起调控作用的KEGG通路,以及雌激素信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟及GnRH信号通路等与卵泡发育密切相关的信号通路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R711.75

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本文编号:2377567

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