双特异性磷酸酶5对滋养细胞增殖凋亡的影响及其相关分子机制的研究

发布时间：2018-12-16 23:54

【摘要】：背景与目的滋养细胞来源于形成中胚泡的滋养内胚层，根据其形态结构可分为：细胞滋养细胞、合体滋养细胞和中间型滋养细胞。滋养细胞增殖、分化、凋亡以及程序性入侵是人类胚胎植入、胎盘形成发育、胎儿生长发育以及妊娠顺利完成的重要因素。已有研究表明，子痫前期的发生与滋养细胞凋亡密切相关，子痫前期患者的胎盘组织中存在滋养细胞凋亡过度现象，，且胎盘滋养细胞的凋亡程度与子痫前期的严重程度呈正相关。子痫前期(pre-eclampsia，PE)是指妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿、水肿，并伴有全身各器官系统损害，是导致孕产妇及其围生儿患病率和死亡率升高的重要原因之一。目前认为，子痫前期是胎盘依赖性疾病，胎盘一旦娩出，患者的相关症状立即消失。因其发病的迅猛性、病情的复杂性及其危害，子痫前期的病因及其发病机制的研究一直是妇产科领域的重要课题。目前较为公认的学说之一是滋养叶细胞缺血学说：即在妊娠早期，滋养细胞凋亡过度引起滋养细胞的浸润能力下降以及血管内滋养细胞的转化过程发生异常，导致血管内皮细胞激活和损伤，胎盘浅着床，胎盘缺血缺氧，使得子宫螺旋小动脉生理性重铸障碍，从而引起子痫前期相关症状。双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)是近年来才发现的，是蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)超家族的一个亚家族，因其对酪氨酸和丝/苏氨酸具有双特异性而备受瞩目。根据其结构特征和序列的相似性可分为典型的DUSP和非典型的DUSP。研究表明，现已知的大多数DUSP家族成员均作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases，MAPK)的负向调节剂参与细胞增殖、分化、代谢、基因转录、离子通道、细胞-细胞通信、免疫应答等以及肿瘤的形成。介于DUSP家族如此广泛的功能，而其在滋养细胞的功能作用却知之甚少，目前仅有一篇文献报道DUSP9与胎盘发生发展及子痫前期的发生密切相关。我们拟利用PCR技术绘制DUSPs在正常早孕绒毛组织、正常晚孕胎盘组织及子痫前期胎盘组织中的动态图谱；结合先前研究及国内外文献，筛选出最有意义的表达差异基因----DUSP5作为本次研究的目的基因。然后拟建立DUSP5过表达及其基因沉默的稳定转染细胞株，深入探讨DUSP5在滋养细胞增殖和凋亡中的作用，以及究竟是通过何种信号转导通路介导滋养细胞增殖和凋亡，为子痫前期发病机制的阐明奠定新的分子机制，也为发展新的临床治疗策略提供可行的靶点。 BeWo细胞系来自人绒毛膜癌组织，为人绒毛膜细胞癌株细胞系之一。相比于其它人绒毛膜细胞癌株JEG-3细胞系、JAR细胞系等，BeWo细胞系对外界刺激后，分泌人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)的能力和融合滋养细胞的能力与晚期妊娠绒毛滋养细胞更为相似。故本研究选取该细胞株作为此次实验的体外细胞模型。材料与方法（一）DUSPs在正常早孕绒毛组织、正常晚孕胎盘组织和子痫前期胎盘组织中的表达差异 1．研究对象：2012年5月-2013年5月在我院确诊并分娩的子痫前期患者的胎盘组织共20例为子痫前期组，同时期血压正常因社会因素或骨盆异常而终止妊娠的正常晚期妊娠孕妇的胎盘组织20例为正常晚孕对照组，同时期无任何疾病或并发症合并症因非计划妊娠于我院门诊行人流的早孕妇女20例为正常早孕组。 2．实验方法：（1）采用半定量PCR和实时定量PCR技术检测DUSPs在三组组织中mRNA的表达，并绘制DUSPs在正常早孕绒毛组织、正常晚孕胎盘组织以及子痫前期胎盘组织中的动态表达谱。（2）采用Western blot技术验证DUSP5蛋白在三组组织中的表达情况。（二）DUSP5过表达及其基因沉默稳定转染细胞株的建立 1．实验材料：正常的BeWo细胞株，DUSP5cDNA表达慢病毒载体、DUSP5RNAi慢病毒载体及其相应的空病毒载体 2．实验方法：采用慢病毒介导方法稳定转染BeWo细胞株，扩大培养后利用流式细胞仪分选阳性细胞。采用qPCR和Western blot技术鉴定稳定转染细胞株是否过表达/沉默目的基因DUSP5。（三）DUSP5对滋养细胞增殖凋亡的影响及分子机制的研究 1．实验材料：正常的BeWo细胞株、DUSP5过表达的稳定转染细胞株、DUSP5基因沉默的稳定转染细胞株及转染了相应的空病毒载体的BeWo细胞株 2．实验方法：采用CCK-8实验检测各组滋养细胞的增殖情况，流式细胞术检测各组滋养细胞的凋亡情况；Western blot技术检测p-ERK1/2、total-ERK1/2、p-p38、total-p38、p-JNK以及total-JNK的表达。结果（一）DUSPs在正常早孕组、正常晚孕对照组和子痫前期组中的表达差异 1. DUSPs各基因在正常早孕组中mRNA的表达量与正常晚孕对照组相比较，均显著增高(P0.01)；而DUSPs在子痫前期组中的表达量与正常晚孕对照组相比较，呈现显著的表达差异：其中DUSP1、DUSP2、DUSP3、DUSP4、DUSP5、DUSP6、DUSP9、DUSP10及DUSP23共9个基因在子痫前期组中的表达量显著减少(P0.01)，而DUSP8、DUSP14和DUSP22基因在子痫前期组中的表达量显著增高(P0.01)，余下的DUSP7和DUSP16在两组间未见明显差异。 2．DUSP5蛋白在正常早孕组显著高表达，随着妊娠的进展在正常晚孕对照组中低表达，而在子痫前期组中显著低表达甚至缺失。（二）建立DUSP5过表达及其基因沉默的稳定转染细胞株 1．经流式细胞仪分选阳性细胞后，荧光显微镜观察见DUSP5过表达组及其相应的空载体组具有明显的红色荧光，而DUSP5干扰组及其相应的空载体组具有明显的绿色荧光。空白对照组未见任何荧光表达。 2．在DUSP5过表达实验中，DUSP5过表达组中DUSP5mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于空白对照组和空载体组(P0.05)；在DUSP5干扰实验中，DUSP5干扰组中DUSP5mRNA和蛋白的相对表达量均显著低于空白对照组和空载体组(P0.05)。两组实验中的空白对照组和相应的空载体组之间无显著差异(P0.05)。（三）DUSP5对滋养细胞增殖凋亡的影响及分子机制的研究 1．CCK-8实验结果：相比于相应的空载体组，DUSP5过表达组的O.D值显著升高，差异有统计学意义(P0.01)，而DUSP5干扰组的O.D值显著降低，差异有统计学意义(P0.01)。 2.流式细胞仪检测凋亡结果：相比于相应的空载体组，DUSP5过表达组+DDP的早期细胞凋亡的百分数显著降低，差异有统计学意义(P0.05)，而DUSP5干扰组早期细胞凋亡的百分数显著增高，差异有统计学意义(P0.001)。 3．DSUP5过表达后p-ERK1/2蛋白显著降低(P0.01)，而DUSP5干扰后p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P0.01)。无论DUSP5过表达或是基因沉默，各组细胞中total-ERK1/2蛋白未见明显变化。MAPK其他信号通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均未见明显变化(P0.05)。 4．Western blot结果：DUSP5干扰组、空载体组和空白对照组分别与U0126共培后，p-ERK1/2蛋白的表达被抑制，而未与U0126共培养的相应对照组中的p-ERK1/2蛋白正常表达，六组细胞中的total-ERK1/2均未见明显变化。 5．流式细胞术统计结果：DUSP5干扰组+U0126的早期细胞凋亡百分数(4.49±0.67%)与DUSP5干扰组+DMSO(12.67±1.00%)相比较，显著降低，差异有统计学意义(P0.001)。而早期细胞凋亡百分数在空白对照组+U0126与空白对照组+DMSO中相比较以及空载体组+U0126与空载体组+DMSO中的相比较，均未见明显变化(P0.05)。结论 1．成功绘制了DUSPs在正常早孕绒毛组织、正常晚孕胎盘组织及子痫前期胎盘组织中的动态图谱，提示DUSPs与胎盘发生发育及子痫前期的发生密切相关。 2．成功建立DUSP5过表达及其基因沉默的稳定转染细胞株，为进一步研究DUSP5基因在滋养细胞中的功能作用提供良好的平台。 3．(1) DUSP5过表达后可促进滋养细胞的增殖、抑制其凋亡，而DUSP5干扰后则抑制滋养细胞的增殖、促进其凋亡，提示DUSP5基因与滋养细胞的增殖凋亡密切相关。 (2) DUSP5过表达后显著下调p-ERK1/2的蛋白水平，而DUSP5基因沉默后显著上调p-ERK1/2的蛋白水平，而对total-ERK1/2蛋白无明显作用；无论DUSP5过表达还是基因沉默，其对MAPK的其它信号通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均无明显作用。提示DUSP5对滋养细胞增殖凋亡的影响可能是通过调节MAPK ERK1/2信号通路实现的。 (3)运用ERK1/2特异性阻断剂(U0126)有效地抑制ERK1/2信号转导通路后，发现由DUSP5基因沉默引起的滋养细胞过度凋亡作用被有效逆转。据此，我们推断DUSP5对滋养细胞增殖凋亡的调节作用是通过ERK1/2信号转导通路实现的。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.244

【参考文献】