促性腺激素对牛未成熟卵母细胞体外发育及大鼠肝S9孵育体系中胆固醇代谢的影响研究

发布时间：2019-01-05 16:31

【摘要】：促性腺激素是人类辅助生殖技术(ART)控制性促排卵中常用的药物。在美国,依赖该药物诞生的试管婴儿占出生婴儿的1%以上。目前,临床上常使用的促性腺激素药物包括Gonal-F, Follism, Bravelle, Luveris, Menopur, Repronex, Norvarel等。促性腺激素在促进多个窦卵泡发育至优势卵泡以及激素药物替代中起到至关重要的作用。卵泡刺激素(FSH)是复杂的异质二聚体糖蛋白,由二个非共价键及α和β蛋白亚单位构成。FSH相对分子质量约30 000 Da。卵泡刺激素是卵泡成熟及产生类固醇激素必需的激素。同时,FSH能促进卵泡生长,刺激颗粒细胞上细胞色素P450家族中芳香化酶的表达；FSH能够产生减数分裂活性物质,启动卵母细胞减数分裂恢复。减数分裂的恢复以卵母细胞核膜的破裂为标志。大量的研究表明,卵泡液中高FSH水平将导致受精失败、胚胎发育异常及种植失败。但小剂量促性腺激素不足以刺激卵巢产生足够多卵子用于常规体外受精-胚胎移植(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)。促性腺激素应用的剂量及联合用药方案是否影响卵母细胞成熟及其发育,其机制尚不清楚。体外研究表明,FSH诱导卵丘细胞上某信号的合成,克服了次黄嘌呤对减数分裂的阻滞。研究发现促减数分裂甾醇(MAS)可诱导体外卵母细胞甚至裸卵成熟。MAS是胆固醇生物合成中羊毛甾醇合成胆固醇的中间产物。MAS家族中最具特点的是从人卵泡液中提取的FF-MAS和牛睾丸组织的T-MAS。FSH是否通过MAS作为信号传导分子诱导卵母细胞成熟或者通过MAS诱导的减数分裂恢复,目前仍然不清楚。1.研究不同浓度Gonal-F; Follism; Bravelle;Luveris;Menopur; Repronex;Norvarel和配对组合促性腺激素Bravelle+Menopur； Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel行牛未成熟卵母细胞体外成熟培养,评估卵母细胞成熟程度,为优化临床促排卵方案以及提高IVF成功率提供基础理论依据。2.研究六组配对促性腺激素Follism+Repronex; Follism+Menopur； Brayclle+Repronex;Bravelle+M-nopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur对牛未成熟卵母细胞行体外成熟培养并授精,评估卵母细胞成熟及胚胎发育情况,筛选出最优的配对促性腺激素,为临床ART促排卵方案的选择提供理论依据。3.探讨三种不同浓度促性腺激素Gonal-F; Follism和Fostimon对大鼠肝S9孵育体系中胆固醇含量的影响,为进一步研究促性腺激素作用机制奠定基础。1标本来源购买美国Minitube公司5202枚牛未成熟卵母细胞,卵泡直径约4-6 mm(GV,MI阶段)；购买河南省实验动物中心健康成年雄性SD大鼠(体重200±20g)20只。2实验方法2.1 IVM培养3921枚牛未成熟卵母细胞培养于不同分组不同浓度的促性腺激素与含10%胎牛血清的TCM-199培养基中, 置于39℃,5%CO2培养箱进行成熟培养。实验分为十组,分别为Gonal-F,Follism,Bravelle,Luveris,Menopur, Repronex,Norvarel;Bravelle+Menopur;Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel。每种药物浓度分别为0,5,10,20,40IU/mL(Norvarel的单位是USP/mL);培养24h、48h后,解剖显微镜下评估COCs扩展程度,倒置显微镜下评估卵母细胞核成熟(GV,MI,MII)及第一极体排出情况。2.2牛精子授精及胚胎培养1281枚牛未成熟卵母细胞加入不同分组的促性腺激素与含10%胎牛血清的TCM-199培养基中行成熟培养,24h后进行牛精子授精。受精后放于10%胎牛血清TCM-199培养基中,置39℃,5%CO2培养箱中进行胚胎培养。实验分为六组,分别为Follism+Repronex; Follism+Menopur; Bravelle +Repronex; Bravelle+Menopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur,未添加药物组设为空白对照组。每种药物浓度为40IU/mL。卵母细胞成熟培养24h后与牛精子进行授精,授精后24、48、72、96h观察胚胎发育情况并评估,培育7-8天评估桑椹胚-囊胚发育情况。2.3大鼠肝S9孵育体系添加不同FSH后检测胆固醇含量购买20只雄性成年大鼠,制备大鼠肝S9孵育体系。将三种FSH药物Gonal-F;Follism和Fostimon配制成高中低三个浓度,加入其中,孵育不同时间,用LC.MSMS方法测定大鼠肝S9中的胆固醇浓度。3.统计学方法应用SPSS17.0软件进行统计学处理,数据以均数士标准差(x士S)表示,统计数据比较采用多因素方差分析和卡方检验,两样本均数比较采用t检验。检验水准α=0.05。1体外卵母细胞成熟情况无论单种还是配对促性腺激素行体外卵母细胞成熟培养均剂量依赖性显著性促进COCs的扩展。Bravelle,Luvens,Menopur和Repronex培养24h后显著性扩展COCs:然而,Norvarel依剂量依赖的方式促进卵母细胞COCs的扩展(10到40IU/m L;P005）。20或40IU/mL Bravelle(B),Luvens(L),Menopur(M),Repronex(R),Gonal-F(G),Follism(F)以及20或40 USP/mL Norvarel (N)培养24h和48h卵母细胞成熟率分别是20IU/mL B为13.1%和45.0%:40 IU/mL B 为25.0%和57.1%20 IU/mL的L为33.3%和37.5%40 IU/mL的L为 33.3%和53.6%;20 IU/mL M为50.0%和71.4%; 40 IU/mL M为56.3%和 76.2%;20 IU/mL R为53.8%和81.3%;40 IU/mL R为55.0%和81.8%;20 IU/mL G为15.1%和16.2%;40 IU/mL G为38.9%和39.5%;l20 IU/mL F为22.2%和39.2%;40 IU/mL F为37.3%和40.6%20 USP/mL N为37.5%和44.4%以及40 USP/mL N为40.0%和71.4%。配对药物组在10或40 IU/mL的M+B,R+B和B+N体外卵母细胞成熟培养24和48h,卵母细胞成熟率分别是M+B(10 IU/mL)为37.9%和66.7%：M+B(40 IU/mL)为80.0%和73.9%R+B(10 IU/mL)为50.0%和73.9%;R+B(40 IU/mL)为81.8%和78.9%;B+N(10 IU/mL)为52.4%和75.0%以及B+N(40 IU/mL)为56.2%和62.5%。实验结果显示高浓度促性腺激素在单种(如N和F)或配对组(如B+N)体外成熟培养48h将导致成熟障碍,所以,促性腺激素浓度在40 IU/mL时行体外成熟培养最合适的时间是24h。2 IVF和早期胚胎发育配对促性腺激素(40 IU/mL)培养24h后,R+F,M+F,R+B,M+B,R+G,M+G与空白对照组比较,卵母细胞成熟率分别是88.4%,93.4%,80.7%,80.9%,82.0%,81.7%和14.19%(P0.05),受精率分别是67.8%,68.2%,71.5%,68.7%,72.1%,63.1%和33.9%(P0.05).8-16细胞胚胎率分别是33.3%,34.1%,40.0%,50.0%,41.5%和31.3%(P0.05)；桑椹胚-囊胚率分别是21.2%,20.5%,26.0%,30.0%,26.8%和25.0%(P0.05)。3 LC-MSMS方法测定胆固醇的线性范围,62.5-1000ng/ml。回收率高,97.5-102.4%；精密度好,RSD3%。4 Follism,Gonal-F促进大鼠肝S9孵育体系中胆固醇的合成,Fostimon促进大鼠肝S9孵育体系中胆固醇的代谢。Follism在大鼠肝S9孵育体系中胆固醇的浓度在0-20min区间是增加的,且有浓度依赖关系；随着孵育时间及浓度的增加,在20min-40min之间,则成下降趋势；随着孵育时间的延长,低浓度的Follism组在40min后,其胆固醇的浓度随之增大,而中、高剂量则在40min-80min升高,80min后开始下降。低剂量的Gonal-F组与对照组比较,在大鼠肝S9孵育体系中胆固醇的浓度在0-100min区间,逐步增加到孵育4Omin后为峰值,然后逐渐下降,与空白组接近。而高、中剂量组变化趋势与低剂量相似,但是变化区间小与低剂量。低剂量的Fostimon组在大鼠肝S9孵育体系中胆固醇的浓度与对照组比较,在0-100min区间是先减少的,到孵育20mmin后为谷值,然后逐渐升高,与空白组接近,且有剂量依赖关系。结论1.七种促性腺激素药物(Gonal-F; Follism; Bravelle;Luveris Menopur; Repronex；Norvarel)在体外培养未成熟卵母细胞可显著性增加COCs扩展及卵母细胞成熟,其中,Menopur和Repronex作用最强,配对组则以Menopur +Follism为著。2.促性腺激素包括FSH.LH及hCG三类分别与体外牛未成熟卵母细胞培养48h均促进卵母细胞成熟。3.六组配对促性腺激素(Follism+Repronex; Follism+Menopur;Bravelle +Repronex; Bravelle+Menopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur)影响胚胎2细胞前的卵母细胞发育及早期胚胎的形成；对未成熟卵母细胞体外培养形成的囊胚,在形态学上比较没有显著性差异。4.LC-MSMS是一种简便,快速和灵敏度高的一种测定方法,可用于大鼠肝S9孵育体系中胆固醇含量测定。重组人FSH和尿源性FSH对胆固醇合成代谢的影响不同,可能与二者促进卵母细胞的成熟机制相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8
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本文编号：2402020