【摘要】：目的:通过调控免疫炎症通路LPS-TLR4-NF-κB上跨膜蛋白TLR4和核转录因子NF-κB的表达,并对孕期和产后LPS-TLR4-NF-κB通路表达进行观察,研究免疫炎症与GDM发生发展的关系。方法:1.抽取20例正常孕妇晨起静脉血15ml,采用Ficoll-hypaque密度梯度离心法获得外周静脉血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并在培养4h、24h、48h、72h时,用counstar(IC1000)细胞计数仪分别计数培养液中PMBC的细胞总浓度、活细胞浓度、死细胞浓度、细胞的活率、细胞的平均直径、细胞平均圆度以及细胞平均结团率,使用重复测量数据方差分析比较不同时间点各数据的差异。对培养液中的LPS及炎症因子和TNF-α的水平分别选择血清中、培养前、培养后以及培养后+LPS四点进行检测,采用t检验来比较不同时段培养板中炎症因子的浓度;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的检测采用鲎试剂显色基质法,TNF-α的检测采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent Assay,ELISA)。2.纳入GDM组和对照组孕妇各30例,抽取晨起静脉血15ml,留血清后取PMBC培养48h,检测血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值,检测培养后两组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平。GDM组培养后按照未加试剂、加入LPS、加入LPS+MBL、加入LPS+PDTC分别再培养24h,分别检测TLR4表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平。采用t检验比较GDM组与对照组血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值;同时比较培养后乙酰化TLR4表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平;采用单因素方差分析和SNK-Q检验的方法对GDM组中未加试剂组、LPS组、LPS+MBL组、LPS+PDTC组中TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平进行两两比较;采用Pearson相关分析对LPS组、LPS+MBL组、LPS+PDTC组中TLR乙酰化4表达、NF-κB表达与TNF-α的水平的相关性进行比较。采用鲎试剂显色基质(微板法)检测培养液中LPS的水平;采用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)法检测TLR4乙酰化的表达;采用Western blot法检测NF-κB(主要为NF-κB-P65)的表达;培养上清液中TNF-α的水平采用ELISA法检测。3.入选GDM与正常孕妇各20例,在孕期(孕24-28周)及产后42天后分别抽取晨起静脉血15ml。检测血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值,同时对所获得PMBC培养48h,分别检测培养后以及培养后加入LPS时的TLR4表达乙酰化、NF-κB表达、以及TNF-α水平,并采用单因素方差分析和SNK-Q检验的方法分别对培养后以及培养后加入LPS时的TLR4表达乙酰化、NF-κB表达、以及TNF-α水平进行两两比较;TLR4乙酰化的表达与NF-κB的表达采用IP及WB法检测;培养上清液中TNF-α的水平采用ELISA法检测。结果:1.随着PMBC培养时间的增加,细胞总浓度不断增加,活细胞浓度和细胞的活率逐渐下降,死细胞浓度和细胞平均结团率逐渐上升,差异有统计学意义(F值见表3,P0.05);细胞的平均直径、细胞平均圆度在各个培养时间点的数值进行比较,各个时间点并没有明显差别(P0.05),本研究认为合适的培养时间为48h。2.LPS仅在血清中能测出,TNF-α的水平在不同的时间段从高到底依次为在培养后+LPS时、血清中、培养后、培养前,差异有统计学意义(P0.05)。3.对照组与GDM孕妇在年龄、孕周上的差异均无统计学意义(P0.05)。,GDM组血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值均高于正常孕妇组,差异有统计学意义(P0.05),体外培养后GDM组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平亦均高于正常孕妇组,差异有统计学意义(P0.05)。4.GDM孕妇PMBC细胞体外培养后LPS组、LPS+MBL组以及LPS+PDTC组中TLR4乙酰化的表达均高于未加试剂组,LPS组与LPS+PDTC组TLR4乙酰化的表达高于LPS+MBL组,差异有统计学意义(P0.05);LPS组与LPS+PDTC组相比,TLR4乙酰化的表达没有区别,差异没有统计学意义(P0.05);LPS组NF-κB的表达高于LPS+MBL组、LPS+PDTC组和未加试剂组,差异有统计学意义(P0.05);LPS+MBL组、LPS+PDTC组与未加试剂组之间NF-κB的表达没有差别,差异没有统计学意义(P0.05)。LPS组TNF-α的水平高于LPS+MBL组、LPS+PDTC组和未加试剂组,差异有统计学意义(P0.05);LPS+MBL组、LPS+PDTC组与未加试剂组之间TNF-α的水平没有差别,差异没有统计学意义(P0.05)。5.在LPS组,TLR4表达、NF-κB表达与TNF-α的水平均相关,(P0.05);在LPS+MBL组,TLR4表达、NF-κB表达与TNF-α的水平均相关,(P0.05);在LPS+PDTC组,TLR4表达与NF-κB表达、TNF-α的水平不相关,(P0.05),NF-κB表达与TNF-α的水平相关(P0.05)。6.GDM孕期组血清LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值分别高于GDM产后组、正常孕期组和正常产后组,差异有统计学意义(P0.05);GDM产后组、正常孕期组和正常产后组三组间血清LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR数值的比较没有差别,差异没有统计学意义(P0.05)。四组PMBC培养后,GDM孕期组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平分别高于其它三组,差异有统计学意义(P0.05);GDM产后组、正常孕期组和正常产后组三组间TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平比较没有差别,差异没有统计学意义(P0.05)。四组PMBC培养并加入LPS后,GDM孕期组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平分别高于其它三组,差异有统计学意义(P0.05);GDM产后组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平分别高于正常孕期组和正常产后组,差异有统计学意义(P0.05);正常孕期组和正常产后组TLR4乙酰化表达、NF-κB表达、以及TNF-α水平比较没有差别,差异没有统计学意义(P0.05)。结论:利用Ficoll-hypaque密度梯度离心法获取PMBC,经过体外培养后,可以构建LPS诱导的PMBC免疫炎症体外模型。GDM孕妇体内LPS-TLR4-NF-κB通路处于活化状态,可以通过调控LPS-TLR4-NF-κB通路中跨膜蛋白TLR4与核转录因子NF-κB活性的来调控通路下游TNF-α的水平,进而影响IR,参与GDM的发生发展。GDM孕妇产后LPS-TLR4-NF-κB通路在不同条件下的变化为GDM是“一过性炎症”状态提供依据,并可能与将来发生2型糖尿病相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.256
【参考文献】
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