RNA结合蛋白LIN28在男胎原始生殖细胞中的表达

发布时间：2019-03-31 13:10

【摘要】：日益增高的不孕不育发生率对人类的健康和生存构成了严重威胁。临床上，不孕症和胚胎早期自然流产、人工助孕不明原因的失败、胎儿遗传疾病及育龄妇女多囊卵巢综合征等生殖方面疾病逐年增多，已成为困扰人们身心健康的世界性问题，也是当今生命科学研究的热点问题。除了生殖功能后天的损伤和污染的影响，胚胎获得性缺陷也占一个很高的比例。有些数据表明，这些病因未明的胚胎获得性缺陷与性腺发育异常及相关基因的缺陷有关。生殖细胞是性腺的重要组成部分，它们的形成和扩增在性腺发育中起决定作用，进而影响繁衍生殖的功能。人类原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）是包括卵子和精子在内的各型生殖细胞的共同起源细胞（祖细胞），PGCs与生殖发育密切相关，在人类的生存和发展进程中发挥重要作用。在妊娠期2-3周，人类早期胚胎开始出现PGCs，定位在胚胎的尿囊和间质的上胚层。到妊娠期的5-6周，PGCs迁徙到原始生殖嵴。迁移后的PGCs经过一系列的扩增与初始分化，形成约5-7百万个卵原或精原细胞，这些原始细胞被支持细胞和体细胞围绕，共同组成早期性腺。PGCs的成熟过程呈阶段性发展并被精密地调控着。本实验主要就迁移后的原始生殖细胞进行研究，这个时期是细胞的增殖和性别分化的决定时期，是由细胞内外因素共同调控的。通过体外诱导胚胎干细胞分化为生殖干细胞，科学家们发现主要的外部因素骨成形素蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)。而内在因素是一系列内源性机制调控不同基因，按照特定的时间和空间严格表达，以确保原始生殖细胞生成的正常活动。内源性机制主要包括四个方面：RNA结合蛋白（RNA-binding Protein，RBP）调控，转录因子调控、全能性基因调控和表观遗传调控。本实验选择RNA结合蛋白LIN28及标记蛋白OCT4进行研究。 LIN28是一种高度保守的RNA结合蛋白，是生殖细胞增殖和分化过程中必不可少的因子，并与人类睾丸生殖细胞肿瘤的发生与恶变密切相关。通过对小鼠的研究，发现LIN28高度表达在小鼠胚胎干细胞和早期胚胎发育过程。体外诱导实验发现，LIN28在人胚胎干细胞中高度表达，并且可以提高诱导多能干细胞向生殖干细胞的转化效率。而八聚体结合转录因子4（Octamer-bindingTranscription Factor4，OCT4），一个著名的早期生殖细胞标记物，在维持胚胎干细胞的多能性和自我更新方面起关键作用。因其在孕早期性腺中特异地高表达，OCT4常用于目前生殖领域的研究标记。然而目前为止，还没有发现其他稳定的指标为判断胎儿生殖细胞的不同发育阶段提供依据。为此，我们选择多能性标记物LIN28与OCT4相比较。寻找适用于生殖细胞发育的不同阶段正确的标记物，从而揭示人类生殖细胞的发生、发育、成熟及受精的调节机制是诊断和治疗不孕不育症和提高优生优育的基础和关键，也将为当今治疗不孕症的主要手段——辅助生育技术提供重要理论依据，并有助于创立新的避孕措施。目的本课题通过对男胎早期性腺组织中生殖细胞特异性因子的检测，分析LIN28和OCT4在原始生殖细胞的表达变化趋势，探索OCT4和LIN28蛋白在胎儿发育初期过程中的表达功能和作用机制。实验目的：为进一步研究PGCs的形成及增殖，理解生殖细胞和早期胎儿发育。以探讨不孕不育、胎儿发育及遗传缺陷主要成因，为不孕、胚胎移植失败、流产和遗传病的诊断和防治提供理论依据。材料与方法收集弃之不用的6 20周的多胎妊娠减胎标本、流产和引产标本的人类胎儿睾丸组织共20例，进行快速冰冻切片和免疫组织化学荧光染色测定组织LIN28和OCT4。使用激光共聚焦显微镜拍照并统计LIN28和OCT4阳性细胞。将标本按胎龄（7周、8周、9周、10周、11-12周、13-14周）分为6组（未发现两种因子的6周减胎标本和只有LIN28单因子表达的20周引产组织不纳入其中），每组n=3，分别统计不同时期两种因子的表达变化及趋势。实验数据以x s形式来表示。定量资料符合正态分布和方差齐性的采用one-wayANOVA分析。应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。以α=0.05为检验水准。结果 1．LIN28在胎儿睾丸发育7-20周的PGCs中高度表达胎儿睾丸组织的免疫组化荧光染色显示了妊娠7-14孕周胎儿睾丸组织中存在LIN28和OCT4蛋白的高度表达。研究发现这些OCT4-标记的阳性细胞在形态学上具有生殖母细胞的典型特征：圆形、规则细胞核，较高的核质比。将这些阳性细胞认定为PGCs。 2．LIN28和OCT4相对表达水平的变化随着胎儿睾丸发育的关键时期，LIN28的表达量逐渐增高，而在胎龄11周后，，早期标记蛋白OCT4阳性细胞就不断减少，到胎龄13周时，已经很少被观测到。在胎龄20周的睾丸组织中，只有LIN28的表达可以在免疫组化结果中观测到。 3．LIN28在PGCs中表达的亚细胞定位变化标记蛋白OCT4在早期胚胎发育过程中的表达一直定位在PGCs的细胞核中。而对于LIN28，定位是变化的。在胎龄第7周，同样表达在PGCs的胞核内。在第8-9周，开始检测到生殖细胞胞核和胞质中均表达LIN28，而10周后，出现部分只在胞质中的阳性细胞。最后，妊娠第11-13周及20周，基本所有的LIN28阳性细胞都定位在细胞质中。 4．LIN28和OCT4在人类原始生殖细胞中存在共定位当PGCs在一个时段同时表达两个蛋白，即荧光下红色（LIN28）与绿色(OCT4)双染色时，我们认为这两个因子在这个时期的特定细胞中共表达。在亚细胞水平（胞核或胞质），如果共表达的两个对象在胞内分布有重叠，我们称为共定位，那么至少为两者可能存在的相互作用提供了一个必要条件。最初，大约60%阳性细胞在细胞核中共同表达两个蛋白LIN28和OCT4。然后，这个比例逐渐增高，在胎龄11周的组织中，共表达比例达到100%。由于LIN28表达表型的变化以及OCT4核定位的稳定性，在7-10周的部分细胞中两个因子共定位于胞核。结论 1. LIN28在胎儿睾丸发育7-20w的原始生殖细胞中高度特异表达，随胎龄增加表达量逐渐升高。证实其作为一个生殖细胞标记因子的可行性和稳定性。 2. LIN28在早期原始生殖细胞中的表达模式经历了由核到质的特殊亚细胞定位变化。 3.研究发现LIN28与全能性基因OCT4的共定位提示两者可能具有更深的相互作用关系，来共同调控原始生殖细胞的形成及发育。创新点本实验首次系统性地描述了RNA结合蛋白LIN28在胎儿早期发育时期的睾丸中原始生殖细胞的表达模式和亚细胞定位变化。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R711.6

【参考文献】