Genistein对人卵巢浆液性乳头状囊腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

发布时间：2019-05-03 18:32

【摘要】：目的：卵巢癌为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一，其发病率位居第三位，而病死率却高居妇科肿瘤之首。卵巢癌早期常无症状，发现时多为晚期，极易发生转移和复发，预后极差，严重威胁广大妇女的生命及健康。手术和化疗是治疗卵巢癌的主要方法，而化疗耐药是其预后差的重要原因之一，因此寻找卵巢癌治疗的新型药物及新型靶点已成为迫切需要。染料木黄酮(Genistein)又称染料木素、金雀异黄素，其化学名为4，5，7-三羟基异黄酮，是一种弱植物雌激素，来源于豆科植物的天然异黄酮类化合物。国内外研究表明，Genistein在肿瘤的发生、发展阶段存在着多重抑制效应，具有多种生物活性，如雌激素样作用、调节细胞周期、诱导细胞凋亡和调节信号通路等作用，对多种肿瘤具有较强的抑制作用。其中对乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等研究较多，对卵巢癌的体内研究有限，本实验以人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV-3细胞裸鼠皮下移植瘤为研究对象，探讨Genistein对人卵巢癌SKOV-3细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其对let-7a靶向抑制高转移率组蛋白HMGA2蛋白的表达的影响，为Genistein在卵巢癌的临床应用及其进一步开发提供理论依据。方法： 1细胞培养及制备细胞悬液：人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV-3细胞系用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清，青霉素100U/L，链霉素100u/L，PH7.4），于37℃，5%CO2培养箱中传代培养。常规培养的SKOV-3细胞，待细胞紧贴培养瓶壁生长，取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，10%胎牛血清终止消化，待细胞充分分散后，对细胞进行计数，置离心管中2000r/min（r=8cm）离心5min，弃上清，加入无血清的1640培养液吹匀，再次离心，弃上清，用无血清的1640培养液制成2.5×107个／ml单细胞的悬液。 2建立裸鼠的卵巢癌皮下移植瘤模型及对裸鼠进行实验分组：4～6周龄的BALB/C雌性裸鼠于SPF级环境下饲养。在无菌条件下，用1ml注射器以每只裸鼠0.2ml细胞悬液（含有5×106个细胞）接种于裸鼠的背侧近前肢处的皮下，于种瘤第7天选择生长出移植瘤且直径达3～6mm的裸鼠入组实验，未见移植瘤生长的裸鼠淘汰实验，符合标准的荷瘤裸鼠随机分成6组:（1）辅料对照组6只（羟丙基β环糊精溶液），（2）低剂量Genistein组6只（50mg/kg/天），（3）中剂量Genistein组6只（150mg/kg/天），（4）高剂量Genistein组6只（450mg/kg/天），（5）顺铂组6只（3mg/kg/天），（6）低剂量Genistein＋顺铂联合用药组6只（剂量同单纯用药）。 3实验药物的制备：Genistein工作液即由0.9%氯化钠注射液配制成的包合物（含4%Genistein，96%羟丙基β环糊精）溶液，辅料对照组工作液由0.9%氯化钠注射液配制成羟丙基β环糊精溶液。工作液均在无菌条件下滤器过滤后，即刻使用。顺铂注射液用0.9%氯化钠注射液稀释成3mg/ml浓度，立刻使用。 4给药方法： Genistein低中高剂量组分别按50mg/kg/day，150mg/kg/day，450mg/kg/day，腹腔注射，连用21天。顺铂组按3mg/kg/day腹腔注射，连续7天。联合用药组Genistein按50mg/kg/day腹腔注射，顺铂注射液按3mg/kg/day腹腔注射（用药时间同单独用药组）。对照组每天腹腔注射相同体积羟丙基β环糊精溶液，连用21天。 5裸鼠重量及移植瘤体积和重量的测量：每天观察裸鼠精神生长精神状态、饮食、活动及大便及移植瘤的生长等情况，给药第1天开始，每周测量一次裸鼠体重，游标卡尺测量一次移植瘤的大小，即最长径（a）和最短径（b）。停药24小时停止观察，脱颈法处死裸鼠，无菌条件下摘取裸鼠移植瘤组织称重，按公式V （mm3）=πab2/6计算移植瘤体积，按公式IR（%）=（1－治疗组肿瘤平均重量/对照组肿瘤平均重量）×100%计算肿瘤抑瘤率。 6免疫组织化学染色检测移植瘤组织中高转移率组蛋白HMGA2蛋白的表达：用4%多聚甲醛固定的移植瘤组织小块（小于0.5×0.5×0.1cm3）进行免疫组织化学染色，研究移植瘤组织中高转移率组蛋白HMGA2的表达。 7用RT-qPCR技术检测移植瘤组织中let-7a的表达：取保存于-80℃冰箱的移植瘤组织，用RT-qPCR技术检测移植瘤组织中let-7a的表达。 8统计学方法：采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行处理。以x±S表示，实验数据进行多个样本均数间比较采用单因素方差分析检验结果，析因设计资料的方差分析和秩转换后多个独立样本的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果： 1实验过程顺利，仅顺铂组裸鼠给药结束后出现轻微精神萎靡、饮食可、活动轻微迟缓、大便正常，未见明显消瘦见其他明显的不适反应。其余实验组未见不良反应，随着实验进程的发展，裸鼠周龄增加，实验组裸鼠的体重均有所增长。顺铂组的裸鼠体重小于对照组，差异有统计学意义。Genistein组裸鼠体重均大于对照组，差异无统计学意义。联合用药组的裸鼠体重小于顺铂组和低剂量Genistein组，差异无统计学意义。 2Genistein组的移植瘤体积和重量均小于对照组，差异有统计学意义，，且随着剂量的增加Genistein抑制作用更加明显。联合用药组的移植瘤体积和重量小于顺铂组和低剂量Genistein组，差异无统计学意义。 3各给药组移植瘤组织HMGA2的表达低于对照组，差异具有统计学意义。 4Genistein组中let-7a表达均大于对照组，差异有统计学意义，低、中、高剂量Genistein组的let-7a表达依次增加，两两之间有统计学差异。联合用药组的移植瘤let-7a表达大于对照组及低剂量Genistein组，差异有统计学意义。结论： 1Genistein是一种无明显毒副反应的天然物质，可以抑制肿瘤细胞的生长，且具有剂量依赖性，与顺铂联合应用能增强抗肿瘤的效果。 2Genistein组中HMGA2表达低于对照组，差异具有统计学意义，顺铂组中HMGA2表达低于对照组，差异具有统计学意义，表明顺铂和Genistein可能通过抑制HMGA2的表达，从而促进细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。 3各给药组let-7的表达均高于对照组，表明顺铂和Genistein均可以促进let-7a的表达，且两者有明显的协同作用，顺铂和Genistein可能是通过促进let-7a的表达来发挥抑瘤作用，并且两者联合应用有明显的协同作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】