MicroRNA-34a通过调控HMGB1影响滋养细胞自噬的研究

发布时间：2019-05-11 05:18

【摘要】：子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠20周之后新发的高血压(舒张压=90mm Hg)和大量蛋白尿(=300mg/24h),占妊娠并发症的2%-8%,连同其他妊娠高血压疾病一起构成全球产妇死亡的主要原因[1,2]。尽管子痫前期的发病机制目前仍未完全阐明,但由于子痫前期的症状会随着胎盘的娩出而减轻或消失,所以认为胎盘在子痫前期发病中起关键作用。构成胎盘的主要细胞是滋养细胞,它包括绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞(EVT)。妊娠过程中,绒毛外滋养细胞侵入子宫肌层,并迁移至子宫螺旋动脉,取代其内皮细胞,引起螺旋动脉重建,在胎盘形成和发育中发挥重要作用。研究表明,绒毛外滋养细胞侵袭不足,引起胎盘着床过浅,血管重建障碍,导致子痫前期等妊娠期疾病的发生。自噬是细胞降解自身成分以维持细胞内环境稳态的一种生物学现象,在缺氧、免疫损伤、饥饿等条件下,通过自噬为细胞提供能量以利于细胞生存,但自噬不足或过度自噬都将影响细胞功能,从而参与多种疾病的发生。研究发现,与正常妊娠孕妇相比,子痫前期患者胎盘组织中自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达增加,表明胎盘组织中滋养细胞的自噬活性增加参与子痫前期的发病。micro RNA-34a(miR-34a)在子痫前期的胎盘组织中表达降低,并且研究证实在人视网膜母细胞瘤中,miR-34a可通过靶向调控HMGB1的表达而抑制细胞自噬。但在子痫前期中,miR-34a与HMGB1以及滋养细胞自噬的关系尚未报道。目的探讨miR-34a能否通过调节JAR和JEG-3细胞中HMGB1的表达从而影响滋养细胞自噬,进而研究miR-34a参与子痫前期发病的可能的机制。材料和方法1研究对象本研究选用人绒毛膜滋养层细胞系JAR和JEG-3细胞(购买自北京鼎国昌盛生物技术有限公司),培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养,所用培养基为含10%FBS、100U/m L青霉素、100μg/m L链霉素的RPMI1640培养基,待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。2方法本研究利用RPMI1640培养基恒温培养细胞,待细胞生长至对数期时,用胰酶将细胞消化,接种至6孔板中,每孔细胞数约为1.0×105,接种完毕,将细胞培养板置于恒温箱中继续培养。细胞生长融合至70%时,对细胞进行后续处理。2.1 miR-34a对JAR和JEG-3细胞中HMGB1表达的影响JAR和JEG-3细胞各分5组:miR-34a mimics组(转染miR-34a mimics)、NC组(转染miR-34a mimics阴性对照)、miR-34a inhibitors组(转染miR-34a inhibitors)、INC组(转染miR-34a inhibitors阴性对照)和空白对照组(未经转染),利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测各组细胞中HMGB1m RNA和蛋白的相对表达量。2.2缺氧对JAR和JEG-3细胞自噬的影响JAR和JEG-3细胞各分两组:正常组(未加Co Cl2)、缺氧组(300μmol/L的Co Cl2处理),采用Western blot检测各组细胞中HMGB1和LC3蛋白的相对表达量,用透射电镜观察各组细胞中自噬小体的数量。2.3 miR-34a对JAR和JEG-3细胞自噬的影响两株细胞分别分4组:miR-34a mimics组、NC组、miR-34a inhibitors组和INC组,各组细胞在转染48小时后用300μmol/L的Co Cl2进行缺氧处理2小时,诱导细胞产生自噬,然后利用Western Blot和透射电镜分别检测各组细胞中HMGB1和LC3蛋白的相对表达量及自噬小体数量改变。3统计学处理本研究所得数据用SPSS21.0软件进行统计学分析,数据以?x±s表示,多组间数据分析采用单因素方差检验,两组数据分析时采用独立样本t检验。以α=0.05作为检验标准。结果1转染miR-34a mimics和inhibitors后JAR和JEG-3细胞中HMGB1m RNA和蛋白的表达水平JAR细胞中HMGB1 m RNA和蛋白的相对表达量:miR-34a mimics组(0.37±0.13,0.59±0.12)低于空白对照组(1.01±0.15,1.01±0.10)和NC组(1.11±0.34,0.91±0.08);miR-34a inhibitors组(1.62±0.25,1.47±0.13)高于空白对照组(1.01±0.15,1.01±0.10)和INC组(0.99±0.16,1.03±0.12),差异均具有统计学意义(P0.05)。JEG-3细胞中HMGB1 m RNA和蛋白的表达水平:miR-34a mimics组(0.56±0.15,0.64±0.06)低于空白对照组(1.00±0.13,0.97±0.16)和NC组(1.00±0.15,0.92±0.13);miR-34a inhibitors组(2.12±0.59,1.37±0.05)高于空白对照组(1.00±0.13,0.97±0.16)和INC组(1.01±0.14,1.04±0.07),差异均具有统计学意义(P0.05)。2缺氧后JAR和JEG-3细胞中HMGB1和LC3的蛋白表达水平及自噬小体数量JAR细胞中,缺氧组HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ相对表达量(1.20±0.10,1.06±0.08)均高于正常组(0.62±0.07,0.45±0.13),缺氧组自噬小体的数量(0.90±0.87)也较正常组(0.20±0.42)增加,差异均有统计学意义(P0.05)。JEG-3细胞中,缺氧组HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ表达水平(1.32±0.21,1.23±0.97)高于正常组(0.70±0.15,0.65±0.19),自噬小体数量(1.20±1.03)也多于正常组(0.10±0.32),差异均有统计学意义(P0.05)。3转染miR-34a mimics和inhibitors并缺氧处理后JAR和JEG-3细胞中HMGB1和LC3蛋白的表达水平JAR细胞中HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ相对表达量:miR-34a mimics组(0.56±0.12,0.48±0.02)均低于NC组(1.04±0.04,1.01±0.03),miR-34a inhibitors组(1.70±0.24,1.48±0.09)均高于INC组(0.82±0.17,0.99±0.06),差异均有统计学意义(P0.05)。JEG-3细胞中HMGB1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅱ的表达水平:miR-34a mimics组(0.48±0.18,0.32±0.87)均低于NC组(1.24±0.28,1.12±0.12),miR-34a inhibitors组(2.13±0.27,1.52±0.15)均高于INC组(1.46±0.21,1.07±0.11),差异均有统计学意义(P0.05)。4转染miR-34a mimics和inhibitors并缺氧处理后JAR和JEG-3细胞中自噬小体的数量JAR和JEG-3细胞中自噬小体数量:miR-34a mimics组(0.10±0.32,0.10±0.31)分别少于NC组(0.70±0.82,1.00±0.82),miR-34a inhibitors组(1.40±0.84,1.50±1.08)分别多于INC组(0.40±0.52,0.50±0.53),差异有统计学意义(P0.05)。结论miR-34a可能通过下调JAR和JEG-3细胞中HMGB1的表达而抑制滋养细胞自噬。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R714.244

【参考文献】