Periostin及大黄素通过ILK通路调控子宫内膜异位症迁移、侵袭能力的作用及机制研究

发布时间：2019-05-19 17:27

【摘要】：研究背景子宫内膜异位症(简称内异症)是一种妇科常见的良性疾病,其在生育期女性中的发病率约为10%-15%；其除了可以引起继发性的进行性加重的痛经或慢性盆腔痛外,还可以引起性交痛和不孕等一系列临床症状。内异症是一种良性疾病,但是其具有异地黏附、种植、侵袭及血管生成等类似恶性肿瘤的生物学行为。由于内异症的发病机制不明确,目前尚缺乏彻底根治内异症的有效方法。因此,深入探讨新的基因功能改变与内异症发生的关系,从分子水平解释其发生的机制,并设计合理的靶向药物治疗对改善内异症预后具有重要意义。Periostin属于Matricellular Proteins家族,该家族蛋白是一种细胞外基质相关分子,其能够介导细胞与细胞外基质(ECM)间相互作用,并且能够增强细胞的生存、黏附和侵袭能力。Periostin在结构上包括其N-末端、一个富含半胱氨酸的结构域(EMI)、四个同源性重复结构域(FAS)以及其C-末端,其中FAS1结构域中含有整合素的结合位点。Periostin与整合素结合后能够激活整合素通路进而调节细胞的生存、黏附和转移。文献报道,Periostin在多种恶性肿瘤中均高度表达,能够促进肿瘤的远处转移。大黄素是一种广泛存在于大黄、首乌、虎杖、决明子等植物根茎中的一种蒽醌化合物。大黄素是多种中草药的主要成分,其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤及免疫抑制等多种生物活性。近年来,有关大黄素在肿瘤治疗中的研究指出大黄素在促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移中具有重要作用。相关报道指出,大黄素通过激活AMPKa和ERK1/2信号通路下调整合素链接激酶(ILK)转录因子Spl和c-Jun的表达而下调ILK的表达进而抑制细胞的生长。整合素链接激酶(ILK)是一种分子量为59KD的胞浆蛋白,在介导细胞与ECM及细胞与细胞间的黏附中发挥重要作用,其能够通过调控多种信号传导通路调节细胞的生存、增殖、迁移及侵袭。此外,ILK在功能上具备丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的活性,可以磷酸化多种下游蛋白,如GSK-3β、Akt、Erkl/2和NF-κB等,参与调节多种信号通路进而调控细胞的生存、增殖、迁移及侵袭。ILK亦能够通过上调上皮间质转化(EMT)相关转录因子的表达促进细胞发生EMT。ILK高表达于多种肿瘤中并与肿瘤转移和预后相关；敲除ILK能够明显抑制细胞EMT、迁移和侵袭能力。第一部分Periosin调控ILK通路促进子宫内膜间质细胞发生迁移、侵袭的作用及机制研究研究目的：1.检测Periostin在子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中的表达；2.探讨Periostin对子宫内膜间质细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。研究方法：采用分离法原代培养人子宫内膜间质细胞(ESCs),包括对照组子宫内膜间质细胞(CSCs)、内异症患者在位子宫内膜间质细胞(EuSCs)和异位子宫内膜间质细胞(EcSCs). Real-time PCR和western blot分别检测子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中Periostin的表达。Western blot检测CSCs、EuSCs和EcSCs中ILK和p-Akt的表达水平。Transwell试验检测CSCs、EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力。干扰EcSCs中Periostin的表达后,real-time PCR和western blot分别检测siRNA-ILK的干扰效率；western blot检测干扰前后EcSCs中 ILK、p-Akt的表达变化；MTT试验、细胞黏附试验、transwell试验分别检测转染前后EcSCs增殖、黏附、迁移和侵袭能力的改变。研究结果：1.ESCs的鉴定及纯度检测：成功分离并培养人ESCs,且细胞的纯度为96.5%±2.5%。2. Periostin、ILK和p-AKT在ESCs中的表达：EuSCs口EcSCs较CSCs中Periostin的mRNA及蛋白表达水平明显升高,且EcSCs中表达水平最高(蛋白水平：EuSCs vs CSCs P0.05, EcSCs vs CSCs P 0.001; mRNA水平：EuSCs vs CSCs P 0.05, EcSCs vs CSCs P 0.05);增殖期内膜较分泌期内膜中Periostin的蛋白表达水平稍高,但差异无统计学意义(P0.05)。此外,EuSCs和EcSCs较CSC s中ILK口p-Akt的表达在蛋白水平上明显升高(P 0.05), EuSCs和EcSCs中表达无明显差异(P0.05)3. Periostin对ESCs中ILK和p-AKT表达的影响：siRNA-Periostin转染后,EcSCs中Periostin的表达水平明显下降(P 0.05), EcSCs中ILK和p-Akt的表达水平亦明显下降(P0.05)。4. Periostin对ESCs增殖和黏附能力的影响：虽然EuSCs和EcSCs的增殖能力较CSCs稍强,但差异无统计学意义(P 0.05); siRNA-Periostin转染下调EcSCs中Periostin表达后,EcSCs的增殖能力无明显变化(P 0.05)。EcSCs的黏附能力较EuSCs和CSCs明显升高(P0.05)；EuSCs和CSCs的黏附能力无明显差异(P0.05)。siRNA-Periostin转染下调EcSCs中Periostin表达后,EcSCs的黏附能力明显下降(P0.05)。5. Periostin对ESCs迁移和侵袭能力的影响：EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力较CSCs明显增高(迁移能力：P0.01；侵袭能力：P0.001)；其中EcSCs的迁移和侵袭能力最强。siRNA-Periostin转染下调EcSCs中Periostin表达后,EcSCs的迁移和侵袭能力明显下降(迁移能力：P0.05；侵袭能力：P0.01)研究结论：1. Periostin能够明显增强子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭能力,对细胞的增殖能力无明显影响。2. Periostin通过调控ILK通路增强子宫内膜间质细胞的黏附、迁移和侵袭能力进而促进内异症的发生发展。第二部分Periosin调控ILK通路诱导子宫内膜腺上皮细胞发生上皮间质转化的作用及机制研究研究目的：1.检测Periostin对子宫内膜腺上皮细胞迁移和侵袭能力的影响；2.探讨Periostin诱导子宫内膜腺上皮细胞发生上皮间质转化(EMT)的作用及机制。研究方法：采用分离法原代培养人子宫内膜腺上皮细胞(EECs); transwell细胞迁移和侵袭试验检测不同浓度Periostin作用前后细胞迁移和侵袭能力的改变;western blot检测不同浓度Periostin作用前后细胞中E-cadherin、keratin、N-cadherin、 vimentib、ILK、p-Akt、Slug和Zebl的表达变化；siRNA干扰EECs中ILK的表达,western blot检测干扰前后细胞中ILK、E-cadherin、keratin、N-cadherin、 vimentin、p-Akt、Slug和Zebl的表达; Perios tin作用于siRNA-ILK干扰后的EECs,检测作用前后细胞中上述相关指标的变化。研究结果：1.EECs的鉴定及纯度检测：成功分离并培养人EECs,且细胞的纯度为95.6%±3.5%。2. Periostin对EECs迁移和侵袭能力的影响：Periostin (20ng/ml和40ng/ml)作用于EECs 48小时后,细胞的迁移和侵袭能力明显增强(迁移能力：2Ong/ml P 0.01,40ng/ml P0.001;侵袭能力：20ng/ml P0.05,40ng/ml P0.01).3. Periostin对EECs中EMT相关蛋白、ILK及p-Akt表达的影响：Periostin作用于EECs 48小时后,E-cadherin和keratin表达下调,而N-cadherin和vimentin表达上调；且Periostin 40ng/ml组结果具有统计学意义(P0.05)。此外,Periostin作用后,EECs内ILK、p-Akt、slug和Zebl的表达水平均升高；且Periostin 40ng/ml组结果具有统计学意义(P0.05)。4.干扰EECs中ILK表达后细胞中ILK, p-Akt及EMT相关蛋白表达的变化：转染siRNA-ILK干扰细胞中ILK的表达后,EECs中p-Akt、slug和Zebl的表达水平均明显下降(P0.05)；细胞中上皮表型标志性分子E-cadherin和keratin表达上调(P0.05),间质表型标志性分子N-cadherin和vimentin表达下调(P0.01)。Periostin (40ng/ml)能够明显减弱上述ILK干扰所引起的变化；但是,与对照组或空载转染组相比,siRNA-ILK转染+Periostin作用组EECs中p-Akt、slug、Zebl以及EMT标志性分子的表达水平无明显改变(P0.05)。表明：ILK干扰后,Periostin失去上调p-Akt、slug和Zebl表达以及诱导EECs发生EMT的能力。研究结论：1. Periostin能够增强子宫内膜腺上皮细胞的迁移和侵袭能力。2. Periostin能够诱导子宫内膜腺上皮细胞发生EMT。3. Periostin通过激活ILK通路诱导EECs发生EMT。第三部分大黄素调控ILK通路诱导子宫内膜间质细胞发生间质上皮转化在抑制细胞迁移和侵袭能力中的作用及机制研究研究目的：1.检测子宫内膜异位症患者在位和异位内膜间质细胞中ILK的表达及细胞的迁移和侵袭能力；2.探讨大黄素对子宫内膜间质细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；3.探讨大黄素诱导子宫内膜间质细胞发生间质上皮转化(MET)的作用及机制。研究方法：采用分离法原代培养人子宫内膜间质细胞(ESCs),包括对照组子宫内膜间质细胞(CSCs)、内异症患者在位子宫内膜间质细胞(EuSCs)和异位子宫内膜间质细胞(EcSCs).Western blot分别检测CSCs.EuSCs和EcSCs中ILK的表达水平。Transwell试验分别检测CSCs.EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力。浓度梯度大黄素作用于EcSCs后,MTT试验和transwell试验分别检测作用前后细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。浓度梯度大黄素作用于EcSCs后,western blot检测作用前后细胞中E-cadherin、keratin.N-cadherin和vimentin的变化。siRNA转染干扰EcSCs中ILK的表达,质粒转染过表达CSCs中ILK的表达；western blot分别检测转染前后EcSCs和CSCs中ILK.E-cadherin.keratin.N-cadherin和 vimentin的表达；transwell试验分别检测转染前后EcSCs和CSCs迁移和侵袭能力的改变。大黄素作用于转染前后的ESCs,检测作用前后细胞中上述指标的变化。研究结果：1.ESCs中ILK的表达及细胞迁移和侵袭能力的检测：EuSCs和EcSCs中ILK的表达水平较CSCs中明显上调,其中,EcSCs中ILK的表达水平最高(EuSCs vs CSCs:P0.01:EcSCs vs CSCs:P0.001).细胞形态方面,与CSCs相比,EuSCs和EcSC s在形态上更加细长,更趋近于梭形细胞。EuSCs和EcSCs的迁移和侵袭能力均较CSCs显著增强；其中,EcSCs的迁移和侵袭能力最强(迁移能力：P0.01；侵袭能力：EuSCs vs CSCs P0.05,EcSCs vs CSCs P0.01).2.大黄素对ESCs增殖、迁移和侵袭能力的影响：大黄素对EuSCs和EcSCs增殖能力的抑制呈时间和浓度依赖性(P0.05)。大黄素作用于EcSCs,细胞体积变小,由长梭形变成较规则的多边形；此外,大黄素能够明显降低EcSCs的迁移和侵袭能力(迁移能力：20μP0.05,40μMP0.01；侵袭能力：20μMP0.05,40μMP0.01)。3.大黄素作用于EcSCs后细胞内ILK及MET相关蛋白的表达变化：浓度梯度大黄素作用于EcSCs 48h,随大黄素浓度的增加细胞中ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显降低(P0.05),而上皮表型E-cadherin 和keratin表达明显升高(P0.05).40μM大黄素作用于E cSCs,随大黄素作用时间的增加细胞中ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显降低(P0.05),而上皮表型E-cadherin和keratin表达明显升高(P0.05)。4.干扰EcSCs中ILK表达后细胞内蛋白表达及细胞迁移和侵袭能力的改变：研究显示ILK在EcSCs中表达水平最高,因此选用ILK siRNA干扰下调EcSCs中ILK的表达。与N.C.组相比,ILK siRNA组ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显下调(P0.001),而上皮表型E-cadherin和keratin的表达水平明显上调(P0.001)。此外,与N.C.组相比,ILK siRNA组细胞的迁徙和侵袭能力明显下降(迁移能力P0.01,侵袭能力P0.001)。大黄素能够强化ILKsiRNA干扰所引起的上述细胞分子及功能改变(P0.05)。5.质粒转染CSCs过表达ILK后细胞内蛋白表达及细胞迁移和侵袭能力的改变：研究显示CSCs中ILK的表达水平最低,因此选用质粒转染过表达CSCs中ILK的表达。与pEGFP-C1空载体组相比,pEGFP-C1-ILK组细胞中ILK、间质表型N-cadherin和vimentin的表达水平明显升高(P0.05),而上皮表型E-cadherin和keratin的表达水平明显降低(P0.05)。此外,与pEGFP-C1空载体组相比,pEGFP-C1-ILK组细胞的迁徙和侵袭能力明显增强(迁移能力P0.01,侵袭能力P0.001)。虽然大黄素能够减弱上述各作用(P0.05)；但是,与无大黄素作用的pEGFP-C1空载体转染CSCs组相比,过表达ILK后大黄素失去了诱导细胞发生MET及抑制细胞迁移和侵袭的能力(P0.05)。研究结论：1.大黄素能够以时间及浓度依赖性抑制子宫内膜间质细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2.大黄素能够诱导子宫内膜间质细胞发生MET抑制细胞发生迁移和侵袭。3.大黄素通过调控ILK通路诱导子宫内膜间质细胞发生MET进而抑制细胞的迁移和侵袭能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R711.71
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本文编号：2480915