光动力增效剂联合FECH-siRNA提高卵巢癌细胞的荧光成像灵敏度研究

发布时间：2019-09-01 20:33

【摘要】：目的研究在单独使用siRNA或单一光动力增效剂的基础上，siRNA和单一光动力增效剂联合应用，以增强基于5－氨基酮戊酸的光动力诊断（5-aminolevulinic acid photodynamicdiagnosis，ALA-PDD）的敏感性，减少ALA用量，避免与其有关的毒副作用。并为进一步应用多种光动力增效剂，或siRNA同多种光动力增效剂联合应用，提高卵巢癌细胞的荧光成像灵敏度提供实验依据。方法 1胶原酶消化法分离人卵巢成纤维HOF细胞，常规培养人卵巢癌SK-OV-3细胞及HOF细胞。 2荧光显微镜检测ALA对SK-OV-3细胞的最佳作用时间及最小有效浓度。 3以Lipofectamine RNAiMAX介导亚铁螯合酶（ferrochelatase，FECH）-siRNA转染，敲减SK-OV-3细胞的FECH，应用RT-qPCR、western blot检测mRNA和蛋白质水平的变化，荧光显微镜检测处理后的SK-OV-3细胞与HOF细胞内原卟啉Ⅸ（protoporphyrin，PpⅨ）荧光强度。 4荧光显微镜检测去铁胺（deferoxamine，DFO）、乙二胺四乙酸二钠钙（Ethylenediaminetetraacetic Acid Calcium Disodium Salt Hydrate，EDTA-Na2Ca）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分别联合ALA在SK-OV-3细胞和HOF细胞出现PpⅨ荧光的最佳条件及三者的增效作用差异，比较siRNA与单一光动力增效剂对SK-OV-3细胞PpⅨ蓄积和荧光成像敏感性的作用。结果 10.3mMALA可诱导SK-OV-3细胞内出现PpⅨ荧光，在诱导的0h至6h内PpⅨ荧光随时间的延长而增强（P0.05），6h至9h为平台期（P0.05），9h后逐渐减弱（P0.05）。 20.3mMALA作用6h，SK-OV-3细胞的PpⅨ荧光强度略强于HOF细胞（P0.01）。 3siRNA敲减SK-OV-3细胞后，FECH-mRNA降至0.05±0.01倍（P0.01），FECH降至0.20±0.07倍（P0.01），与ALA联合应用后细胞PpⅨ荧光明显增强（P0.05）；相比之下HOF细胞在转染后其PpⅨ荧光强度无明显变化（P0.05）。 4DFO单独处理SK-OV-3细胞不能增强PpⅨ荧光（P0.05），但联合应用ALA可提高荧光强度（P0.01），其浓度在5mM至30mM荧光强度基本相似（P0.05），作用时间为5h时，PpⅨ荧光最强（P0.05）。 5EDTA-Na2Ca单独处理SK-OV-3细胞不能增加其PpⅨ荧光强度（P0.05），联合应用ALA则可增加荧光强度（P0.01），且在0mM至125mM之间细胞的PpⅨ荧光强度与浓度呈正相关（P0.05），，作用时间在2h至5h时，荧光强度无明显变化（P0.05）。 6DMSO单独作用于SK-OV-3细胞不能增强PpⅨ荧光强度（P0.05），联合应用ALA时则有增强作用（P0.01），DMSO的最适浓度为6%（P0.05），最佳作用时间为3h（P0.05）。 7对HOF细胞而言，DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO各自联合ALA均不能增强细胞的PpⅨ荧光（P0.05）；对SK-OV-3细胞而言，以上三者均能增强PpⅨ荧光强度，三者之间无显著差异（P0.05），但显著高于对HOF细胞的作用（P0.01）。 8EDTA-Na2Ca或DMSO联合siRNA较三者单独应用更加有效增强SK-OV-3细胞的PpⅨ荧光（P0.05）；DFO联合siRNA与单独使用siRNA相比，SK-OV-3细胞的PpⅨ荧光强度无明显增强（P0.05）。结论 1ALA诱导SK-OV-3细胞荧光显微镜下产生PpⅨ荧光的最佳时间为6h，最低有效浓度为0.3mM；在此条件下SK-OV-3细胞比HOF细胞产生更强的PpⅨ荧光。 2Lipofectamine RNAiMAX介导FECH-siRNA转染SK-OV-3细胞后可显著敲减FECHmRNA和蛋白质的表达，并增强联用低剂量ALA时的PpⅨ荧光强度；但并不增强HOF细胞的PpⅨ荧光强度。 3DFO、EDTA-Na2Ca、DMSO分别联合ALA均能增强SK-OV-3细胞的PpⅨ荧光强度，但均不能增加HOF细胞的PpⅨ荧光强度。 4siRNA联合EDTA-Na2Ca或DMSO时，与ALA存在协同效应，而siRNA联合DFO不能进一步增强ALA的作用。 5本研究证实不同作用靶点方法的联合应用能更有效地提高卵巢癌细胞的PpⅨ荧光强度，应用光动力增效剂可以扩大卵巢癌细胞与正常细胞的荧光差异，从而使ALA的靶向性更加明显且对正常细胞的损害降至更低水平。
【图文】：

血红[6]

曲线,典型形态,标尺,作用时间

各实验组平均OD值以ALA-PpⅨ荧光标准曲线校准后可见ALA作用时间在2～6h之间时，PpⅨ特异性红色荧光的强度随作用时间的延长而增强，其各组之间的差异有统计学意义（P<0.05）。作用时间在 6～9h 之间时，PpⅨ荧光的强度不再随作用时间的延长而增强，各组间没有统计学差异（P＝0.226）。作用时间超过 9h 后 PpⅨ荧光强度随作用时间的延长出现明显下降，10h 组与 6～9h 各实验组间的存在统计学差异（P<0.05）（图 1－4）。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】