硫化氢对人子宫内膜基质细胞蜕膜化及其生物学特性的调节

发布时间：2019-09-02 11:06

【摘要】：研究背景与目的：胚胎植入是指从胚泡着床到胎盘形成的一系列复杂的生理过程。在这一过程中，胚胎发育到胚泡阶段开始着床，子宫内膜蜕膜化后增殖分化到容受性状态，胚胎和母体间相互协作，共同完成。多种细胞因子、转录因子和激素等作用于该过程。胚胎植入失败是临床上早期流产和辅助生殖技术（IVF-ET）中移植失败的关键因素。目前对于胚胎植入过程分子机制的研究尚不是十分清楚。在母体方面，一方面蜕膜化子宫内膜基质细胞与多种细胞因子、生长因子和激素作用，调节胚胎绒毛外细胞滋养层细胞多种基因的表达，其中前列腺素E2可以通过促进子宫内膜基质细胞的蜕膜化促进胚胎植入。另一方面蜕膜化后的子宫内膜基质细胞的生物学特性的增强，即迁移和侵袭能力提高，与滋养层细胞的迁移和侵袭可以形成良好的互动，促进胚泡的植入。因此，子宫内膜基质细胞的蜕膜化及迁移和侵袭的能力对胚胎的植入过程起着非常重要的作用。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是体内的气体信号分子，在多种生理病理过程中发挥重要的功能。研究表明H2S可以作为炎性因子参与炎症反应，调节血管平滑肌以及神经系统的功能，同时在女性的生殖系统中发挥重要的作用。本实验从胚胎植入过程中母儿界面的母面入手，将H2S与胚胎植入的过程相联系，研究H2S对子宫内膜基质细胞蜕膜化及其生物学特性的影响因素，探讨其对胚胎植入的作用。研究内容及方法：1、H2S对人子宫内膜基质细胞蜕膜化的作用。临床上收集人子宫内膜组织标本，免疫组化检测H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）的表达情况，结果表明在人子宫内膜组织的基质细胞和上皮细胞中均可表达H2S合成酶CBS和CSE。说明人的子宫内膜组织可能能够自体合成H2S。我们对人子宫内膜基质细胞进行原代分离、培养和鉴定，构建人体外子宫内膜基质细胞的蜕膜化模型。用Western-blot方法检测H2S合成酶CBS和CSE在人子宫内膜基质细胞中的表达情况，发现CBS和CSE在蜕膜化过程中表达增加，CBS的增加更为明显，提示H2S参与了人子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程。为进一步研究H2S对子宫内膜基质细胞蜕膜化的作用，在子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程中分别加入了H2S合成酶CBS的抑制剂AOAA，H2S合成酶CSE的抑制剂PAG，抑制H2S合成，Real-Time PCR方法检测子宫内膜基质细胞蜕膜化程度的标志性分子催乳素(prolactin, PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein1,IGFBP1)的表达，ELISA法检测其在细胞上清液中的表达情况，，结果提示，CBS的合成受到抑制后，子宫内膜基质细胞的蜕膜化程度降低，在给予外源性H2S供体NaSH后可以逆转AOAA对蜕膜化的抑制效应。CSE的合成受到抑制后，子宫内膜基质细胞的蜕膜化程度无明显改变。同时，我们在蜕膜化中用CBS siRNA转染子宫内膜基质细胞，干扰CBS的表达，用CSE siRNA转染子宫内膜基质细胞，干扰CSE的表达，减少的H2S合成，Real-TimePCR和ELISA方法检测细胞和上清液中PRL和IGFBP1的表达，结果表明CBS的表达被干扰后，子宫内膜基质细胞的蜕膜化程度降低，外源性H2S供体NaSH后可以逆转CBS siRNA对蜕膜化的抑制效应。CSE siRNA对子宫内膜基质细胞的蜕膜化程度无明显改变。以上提示H2S可以对子宫内膜基质细胞蜕膜化起到促进作用，其中H2S合成酶起到了主要的作用。 2、H2S对人子宫内膜基质细胞蜕膜化中前列腺素E2生成的调节。在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中加入H2S合成酶CBS的抑制剂AOAA，H2S合成酶CSE的抑制剂PAG，抑制H2S合成，Western-blot方法检测前列腺素合成酶（环氧化物水解酶cyclo-oxygen-ase,COX-2）的表达情况，结果表明CBS被抑制后COX-2的表达下降，给予外源性H2S后可以逆转这一效应。同时用ELISA方法检测细胞上清液中前列腺素E2（PGE2）的生成，提示PGE2的合成减少。CSE被抑制后COX-2以及PGE2的生成无明显改变。同样我们在蜕膜化中用CBS siRNA转染子宫内膜基质细胞，干扰CBS的表达，Western-blot方法检测到COX-2的表达降低，同时ELISA方法检测到细胞上清液中PGE2的合成减少。用CSE siRNA转染子宫内膜基质细胞，干扰CSE的表达后COX-2以及PGE2的生成无明显改变。以上结果提示H2S促进子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中前列腺素合成酶COX-2的表达及PGE2的合成。由于PGE2可以促进子宫内膜基质细胞的蜕膜化，我们认为H2S可能通过上调PGE2的合成促进子宫内膜基质细胞蜕膜化。 3、H2S对人蜕膜化子宫内膜基质细胞生物学特性的影响。在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中加入H2S合成酶CBS抑制剂AOAA，H2S合成酶CSE的抑制剂PAG，使H2S合成减少，利用MTT法检测AOAA和PAG对细胞增殖的影响，同时我们用CBS siRNA和CSE siRNA转染子宫内膜基质细胞，同样利用MTT法检测其细胞增殖的影响，结果表明在子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中，减少H2S的生成，对细胞的增殖无明显影响。我们利用细胞划痕实验和transwell实验检测H2S对蜕膜化的子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力的影响，结果表明CBS合成受到抑制后，子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力下降，CSE合成受到抑制后，子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力无明显改变。同时我们用CBS siRNA和CSE siRNA转染子宫内膜基质细胞，干扰CBS和CSE表达，结果表明CBS被干扰后蜕膜化的子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力降低，CSE被干扰后蜕膜化的子宫内膜基质细胞迁移和侵袭能力无明显改变。以上结果提示H2S可以促进蜕膜化人子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭能力。结论：本实验在人体外子宫内膜基质细胞蜕膜化模型的基础上，研究了H2S对人子宫内膜基质细胞蜕膜化及其生物学特性的作用。结果表明H2S可能通过上调前列腺素E2的合成促进子宫内膜基质细胞蜕膜化，H2S可以增强蜕膜化子宫内膜基质细胞的迁移和侵袭能力。进一步表明了H2S对胚胎植入过程具有促进作用。本实验为临床上研究胚泡着床失败导致的早期自然流产和IVF-ET术移植失败提供一定的理论基础。
【图文】：

基质细胞,波形蛋白,抗体,红色荧光

图 1-2.人子宫内膜基质细胞普通光学显微镜形态学观察Fig 1-2. Cytomorphological examination of endometrial stromal cell in human.Images are at 100× and 200× magnification.（二）细胞免疫化学染色鉴定为了验证我们原代培养的人子宫内膜基质细胞，我们使用免疫荧光化学染色鉴定人子宫内膜基质细胞可特异地表达波形蛋白。我们利用 PE 标记鼠抗人波形蛋白抗体对其行鉴定，如图 1-3 所示:（A，D）细胞用 DAPI 进行细胞核染色，荧光下显示为蓝色；（B，E）分别为使用 PE 标记鼠抗人 IgG1 抗体（同型对照）和 PE 标记鼠抗人波形蛋白抗体对细胞质进行染色，基质细胞可以被 PE 标记鼠抗人波形蛋白抗体染成红色，而同型抗体 IgG1 组，显示为阴性，证明原代分离的基质细胞因为特异的表达波形蛋白被激发红色荧光，而不是因为具有相同的 IgG 被激发红色荧光；（C，F）为图 A+B，图 D+E 的叠图。人子宫内膜基质细胞纯度=波形蛋白标记为红色的总细

基质细胞,子宫内膜异位,免疫荧光,鉴定结果

图 1-3.子宫内膜异位基质细胞免疫荧光鉴定结果Fig 1-3. Representative photomicrographs of the fluoroimmunoassay for vimentin in the isolated endometrial stromal cells. The cells were stained with DAPI (A,D), mouse IgG1 PE (B) and mouse-anti-human vimentin PE (E). The graphs (A and B; D and E) were merged on the right (C; F) respectively.三、人子宫内膜基质细胞体外蜕膜化模型的建立我们为了构建人子宫内膜基质细胞的体外蜕膜化诱导模型，对原代培养的人子宫内膜基质细胞的 P1 代进行蜕膜化诱导，诱导方法为加入 10-7M MPA 和 5×10-4M 8-Br-cAMP(M+A)。结果显示：图 1-5(A)为原代培养的人子宫内膜基质细胞呈梭状，分散型生长。(B)为蜕膜化诱导 72h 后的内膜基质细胞，细胞增殖，典型的梭状形态消失，细胞核变大。均在普通光学显微镜下 100×下观察。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8

【参考文献】