MiR-101通过调控ZEB1和ZEB2抑制浆液性卵巢癌EMT的研究

发布时间：2020-02-08 14:15

【摘要】：卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤；大多数病人在确诊后5年内死亡。预后差主要是由于多数病人确诊时已是晚期,肿瘤大多已发生转移。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移过程中的重要组成部分。通过对卵巢癌的整合性分析,我们发现了调控EMT过程的主要的microRNA(miRNA)调控网络,其中包括miR-101。本研究中,我们讨论miR-101在EMT调控过程中的作用。通过荧光素酶报告基因分析,我们证明miR-101通过直接抑制ZEB1和ZEB2的3’非编码区(3'-untranslated region3'-UTR),从而上调E-cadherin的表达。过表达miR-101可显著抑制EMT过程及肿瘤细胞的迁移和侵袭。过表达ZEB1或ZEB2基因,miR-101不能增加E-cadherin的表达。上调卵巢癌细胞中miR-101的水平,miR-200家族无明显变化。我们的研究表明miR-101可通过调控E-cadherin的两个转录抑制因子,从而调控EMT过程,此过程不依赖于miR-200家族。本研究分为四个部分进行： 1.对TCGA数据中459例浆液性卵巢癌的DNA拷贝数变化,启动子甲基化及miRNA表达数据进行整合分析,识别TCGA中间质表型基因表达谱。筛选7个浆液性卵巢癌细胞系,测定7个细胞系miR-101及E-cadherin的表达水平,检查二者是否存在正相关。 2.将miR-101转染进卵巢癌细胞系,观察外源性miR-101对卵巢癌细胞EMT、迁移及侵袭的影响。 3.构建pmirGLO-ZEB1, pmirGLO-ZEB2质粒和pmirGLO-ZEB13'-UTR-Ml, pmirGLO-ZEB13'-UTR-M2以及pmirGLO-ZEB23'-UTR-M突变质粒。检测miR-101是否直接靶向调控ZEB1和ZEB2。检测miR-101是否能够下调ZEB1和ZEB2的水平。 4.分别使用2个针对不同作用位点的siRNA下调卵巢癌细胞中ZEB1或ZEB2蛋白的表达,观察是否同转染miR-101后的效果相似。构建ZEB1和ZEB2过表达质粒pcDNA3.1(+)-ZEBl和pcDNA3.1(+)-ZEB2,转染卵巢癌细胞,筛选稳定转染的细胞系。将miR-101转染稳定克隆细胞,观察ZEB1和ZEB2的表达是否下调,E-cadherin表达水平是否依然升高,以证实miR-101对EMT的抑制作用是由ZEB1和ZEB2介导的。通过本实验,可以得出以下几个结论： 1.对TCGA数据中459例浆液性卵巢癌进行整合分析,将其分为上皮亚型(iE)和间质亚型(iM),后者与预后差相关。8个1niRNAs (miR-25, miR-506, miR-29c, miR-182,miR-128,miR-101,miR-141,and miR-200a)可调控89%的miRNA相关基因,且在iM中的表达低于iE。miR-101在iM亚型中低表达和DNA拷贝数缺失有关。MiR-101在上皮性卵巢癌细胞系中的表达显著高于间质性细胞系。 2.MiR-101可以显著增加上皮标志物E-cadherin的水平,下调间质标志物Fibronectin, N-cadherin及Vimentin,改变卵巢癌细胞形态,抑制卵巢癌细胞迁移及侵袭能力。 3.MiR-101通过与ZEB1和ZEB2的3’UTR种子序列特异性结合,直接调控二者的表达,从而抑制卵巢癌EMT过程。 4.MiR-101上调E-cadherin,抑制EMT过程,是通过与ZEB1或ZEB2的3’UTR上miR-101结合位点结合发挥的作用,该调控不依赖于miR-200家族成员。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】